玉竹提取物A對小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子產(chǎn)生的影響.pdf

1、目的：
　　 玉竹(Polygonatum Odoratum(Mill.)Druce)是百合科黃精屬中草藥,藥用根莖中含有多糖、黃酮、生物堿、甾體皂苷、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強心苷等多類成分?，F(xiàn)代藥效學研究證明玉竹有抑制免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老和降血糖等作用。玉竹提取物A是一種醇水提取物,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制細胞免疫功能和炎癥反應的特點,前期試驗已經(jīng)證明一定濃度的玉竹提取物A可以抑制炎癥細胞釋放IL-1和TNF-α等促炎癥

2、細胞因子,鑒于玉竹提取物A具有低毒和安全的特點,進一步研究其在抗炎方面的作用和機制是非常必要的。
　　 一氧化氮(Nitric oxide,NO)參與炎癥及免疫反應等過程,在病理情況下合成的大量NO會引起急、慢性炎癥反應。內(nèi)源性的NO是由一氧化氮合成酶(NOsynthase,NOS)氧化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生的。NOS有三種同功酶即內(nèi)皮型(endothelial NOS,eNOS或NOS-Ⅲ)、神經(jīng)型(neuronal N

3、OS,nNOS或NOS-Ⅰ)和誘生型(inducible NOS,iNOS或NOS-Ⅱ)。iNOS只在炎癥細胞受到刺激被激活后才表達,尤其是巨噬細胞。iNOS主要存在于細胞質(zhì)中,誘導iNOS的刺激物包括血紅素、脂多糖、細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-1α等。許多實驗已經(jīng)證實,體內(nèi)iNOS被激活后,釋放出的大量NO與多種病理改變相關(guān),包括組織損傷和多種炎癥疾病、神經(jīng)疾病和自身免疫性疾病等。因此,選擇性的抑制iNOS進而抑制過量NO產(chǎn)

4、生,將對以上疾病的治療具有一定的應用前景。iNOS抑制劑具有阻斷炎癥信息傳遞通道的作用,有效地抑制iNOS不僅能在初始階段影響炎癥的發(fā)生,也對抑制和終結(jié)炎癥有作用。
　　 前期實驗已經(jīng)證實,玉竹提取物A在一定程度上能抑制由LPS誘導的巨噬細胞分泌促炎癥細胞因子(如IL-1和TNF-α),達到抑制炎癥反應的作用。本實驗旨在進一步證實這一結(jié)果,同時研究玉竹提取物A能否對炎癥損傷中占有重要作用的炎癥介質(zhì)NO同樣起到抑制作用,并且進一步

5、揭示其內(nèi)在機制。研究玉竹提取物A對LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生的炎性介貢--NO、IL-6和TNF-α的影響的同時,也檢測玉竹提取物A對iNOS表達的影響。從而進一步驗證玉竹提取物A對小鼠巨噬細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 實驗方法
　　 取清潔級6-8周齡雌性BALB/c小鼠4只,無菌條件下取小鼠腹腔細胞,于37℃5％CO2條件下培養(yǎng)1 h,去除未貼壁細胞,貼壁的巨噬細胞經(jīng)胰酶消化,收集、離心和清洗后計數(shù)細胞數(shù),調(diào)整細胞密度

6、為2×106/ml。臺盼藍染色,細胞活力>99％,即為提純的腹腔巨噬細胞,備用。將提純的腹腔巨噬細胞以2×106/ml的密度加入96孔培養(yǎng)板中,實驗分組包括空白對照組(巨噬細胞+培養(yǎng)基)和玉竹提取物A各濃度實驗組(15.625-1000μg/ml玉竹提取物A+巨噬細胞+培養(yǎng)基),各孔終體積均為200μl,細胞終密度是1×106/ml,一式5復孔。在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h,MTT法檢測巨噬細胞存活率。將上述提純的腹腔巨噬細胞以同樣密度分

7、別加入兩塊96孔培養(yǎng)板中,采取同樣分組,空白對照組(巨噬細胞+培養(yǎng)基)、LPS對照組(LPS+巨噬細胞+培養(yǎng)基)和玉竹提取物A各濃度實驗組(250-1000 μg/ml玉竹提取物A+LPS+巨噬細胞+培養(yǎng)基)。其中一塊板在37℃5％CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6h,采用ELISA法檢測上清中IL-6和TNF-α的水平；其中另一塊板在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h,Griess法檢測上清中NO的水平。同時用Western blotting法檢測細胞中i

8、NOS表達情況。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差((X)±s)表示,經(jīng)t檢驗處理,p<0.05為差異顯著。
　　 實驗結(jié)果
　　 經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn),玉竹提取物A在15.625-1000μg/ml濃度范圍內(nèi)對小鼠腹腔巨噬細胞的活力無明顯影響,沒有直接的細胞毒作用。通過ELISA檢測,結(jié)果證明玉竹提取物A在500-1000μg/ml的劑量范圍內(nèi)具有明顯抑制LPS活化的小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-6和TNF-α的作用(p<0.05),并

9、具有一定劑量依賴性。經(jīng)Griess法檢測,結(jié)果證實玉竹提取物A在250-1000μg/ml的劑量范圍內(nèi)可明顯抑制活化小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO(p<0.05),也呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。通過Westernblotting法檢測,結(jié)果表明1000μg/ml玉竹提取物A能夠在一定程度上抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO,是通過下調(diào)iNOS的表達而達到的。
　　 討論：
　　 本實驗研究了玉竹提取物A對活化小鼠腹腔巨噬細胞

10、增殖抑制的作用,證明玉竹提取物A在15.625-1000μg/ml濃度范圍內(nèi)對小鼠腹腔巨噬細胞的活力無明顯影響。通過檢測玉竹提取物A對活化小鼠腹腔巨噬細胞分泌促炎癥細胞因子的抑制作用,得出在500-1000μg/ml的劑量范圍內(nèi)玉竹提取物A具有明顯抑制IL-6和TNF-α這些促炎癥細胞因子的作用,同時,也具有一定劑量依賴性。
　　 研究玉竹提取物A對小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的抑制作用證實玉竹提取物A在250-1000μg/ml的

11、劑量范圍內(nèi)可明顯抑制活化小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO(p<0.05),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。
　　 通過Western blotting法檢測玉竹提取物A對iNOS表達的影響。結(jié)果表明高濃度玉竹提取物A能夠一定程度上抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO,是通過下調(diào)iNOS的表達而達到的。
　　 巨噬細胞具有非特異性吞噬和抗原提呈的功能,在非特異性和特異性免疫應答過程中發(fā)揮重要的作用。巨噬細胞免疫應答是機體發(fā)揮防御機制

12、的基礎(chǔ),當細菌侵入機體繁殖和被殺滅時,有大量的內(nèi)毒素釋放到體液中,刺激巨噬細胞的活化并釋放過量的炎癥因子,如NO、TNF-α、IL-6等,從而造成瀑布式的炎癥失控性反應,使組織損傷并成為炎癥?；罨木奘杉毎ㄟ^iNOS途徑產(chǎn)生大量的NO,iNOS是NO產(chǎn)生的三種重要酶類之一。通過對iNOS的調(diào)控,從而控制活化巨噬細胞對NO的釋放,以至于調(diào)控免疫功能。以上結(jié)果提示玉竹提取物A很有可能是一種新型有效的抗炎藥物的候選者,從中草藥中篩選出新的低

13、毒安全的抗炎藥物可能是一條有效的途徑。
　　 由于傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥物被報導稱有包括增加心血管風險等在內(nèi)的較多副作用,因此,新型安全的抑制炎癥藥物的研究與開發(fā)勢在必行。已有研究表明,玉竹提取物A是一種低毒安全的中藥提取物(其半數(shù)致死率LD50用寇氏法計算為14.5124 g/kg)。研究玉竹提取物A在炎癥及免疫疾病中的應用價值,為臨床應用玉竹提取物A治療炎癥疾病和中藥玉竹的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。
　　 結(jié)論：<