甘草多糖的提取及對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié).pdf

1、幾千年來，甘草因具有廣泛的醫(yī)用藥用價(jià)值，被歷代名醫(yī)尊稱為“眾藥之王”。甘草多糖(glycyrrhizapolysaccharid，GP)是甘草中重要活性成分之一，近些年來的藥理學(xué)研究表明，GP具有增強(qiáng)免疫、噬菌、抗病毒、抗補(bǔ)體等作用，且沒有細(xì)胞毒副作用，但目前對GP的研究相對較少，并且多以粗多糖為試驗(yàn)材料。本論文以提取純化GP為原料，詳細(xì)研究了GP對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理。 首先，對影響GP提取率的主要因素進(jìn)行了研究，先采用單因

2、素試驗(yàn)確定出合適的水平，然后利用響應(yīng)面程序進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件為液固比10.27:1，浸提溫度88.53℃，浸提時(shí)間140.97min，提取次數(shù)為2次，理論上粗多糖提取率可達(dá)4.25％，其中浸提時(shí)間對提取率的影響最大。通過對多糖析出條件的研究，證明濃縮后體積為提取液總體積的1/4-1/5，濃縮液與無水乙醇的體積比在1:3-1:4，在4℃條件多糖提取率較高，GP經(jīng)過DEAE-52和G-200層析柱的洗脫分離，冷凍干燥后為純度約為90.7

3、％，多糖得率約為0.87％。 通過高效液相色譜法確定GP的相對分子量約為11kDa。利用原子力顯微鏡觀察，GP是具有空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜大分子，是以葡萄糖為主鏈，通過α-(1，4)鍵連接的單一吡喃型葡聚糖結(jié)構(gòu)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GP分子鏈呈現(xiàn)出單個(gè)的分子鏈及其多個(gè)側(cè)枝的結(jié)構(gòu)，并且還有些大大小小的環(huán)狀和螺旋狀結(jié)構(gòu)，GP分子間存在螺旋(有序)和線圈(無序)間的可逆熱轉(zhuǎn)換，這兩種狀態(tài)具有共存現(xiàn)象。 通過研究GP對巨噬細(xì)胞化學(xué)形態(tài)學(xué)影響及進(jìn)行化

4、學(xué)定量分析，初步探討了GP對巨噬細(xì)胞激活的作用機(jī)理。研究表明巨噬細(xì)胞受到GP刺激進(jìn)一步分化成熟，成為活化巨噬細(xì)胞，使細(xì)胞體積增大，活力增強(qiáng)，糖氧化作用和吞噬功能增加，促使細(xì)胞內(nèi)溶菌酶大量增多，細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、糖原體、ACPase、ANAE、ATPase和SDH等多種酶活性顯著增強(qiáng)，并能明顯增強(qiáng)SOD和O2-的活性。巨噬細(xì)胞膜上的非特異性受體通過其終端的-OH基與多糖-H基結(jié)合，啟動了細(xì)胞內(nèi)環(huán)化酶系統(tǒng)，使細(xì)胞的cGMP增加，致細(xì)胞內(nèi)

5、酶的分泌及活性增加，細(xì)胞代謝能力提高，奠定了巨噬細(xì)胞活化的基礎(chǔ)。 細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞中重要的免疫因子，進(jìn)一步從細(xì)胞因子的角度考察了GP對巨噬細(xì)胞的激活機(jī)理。結(jié)果證明當(dāng)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)48h，在GP添加0-400μg/mL范圍內(nèi)，能劑量依賴地增加巨噬細(xì)胞中IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α和淋巴細(xì)胞中IL-2的分泌量，其中IL-6的分泌量最大。同樣培養(yǎng)時(shí)間(0-72h)也能明顯影響細(xì)胞因子的分泌量，在72h時(shí)分泌量最大。

6、 NO作為信息分子和細(xì)胞毒分子的雙重因子，通過研究GP對NO、iNOS和核蛋白的影響證明：GP添加濃度和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對NO、iNOS和核蛋白的生成量都有明顯的影響，隨著GP添加濃度的增加和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長，NO、iNOS和核蛋白的生成量明顯增加。GP與LPS/IFN-γ協(xié)同實(shí)驗(yàn)證明：GP與LPS/IFN-γ協(xié)同增加NO和iNOS分泌量，并明顯高于相應(yīng)的單獨(dú)添加GP組。用LPS預(yù)刺激巨噬細(xì)胞，再加入GP產(chǎn)生的NO、iNOS和核蛋白量以及

7、增加趨勢明顯高于同時(shí)添加LPS和GP產(chǎn)生的量。巨噬細(xì)胞抗腫瘤、抗病毒、抑制胞內(nèi)病原體增殖等作用主要通過NO的釋放完成的。 mRNA是聯(lián)結(jié)基因與表達(dá)產(chǎn)物之間的橋梁，基因活化的直接結(jié)果是mRNA轉(zhuǎn)錄的增加，而蛋白質(zhì)的合成依賴于mRNA的翻譯。采用RT-PCR方法研究GP對巨噬細(xì)胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12p35、iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)GP直接影響蛋白質(zhì)代謝，可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)節(jié)蛋白