桔梗多糖結(jié)構(gòu)鑒定及其對雞腹腔巨噬細胞免疫活性的影響.pdf

1、免疫增強劑可增強或調(diào)節(jié)機體的免疫能力，在動物臨床實踐中常與各類疫苗配合使用，提高免疫效果，增強機體抵抗力，防止或改善免疫抑制，對傳染性疾病的防控有著積極的作用。許多藥理和臨床研究表明，多數(shù)中藥均具有免疫促進作用，作為其活性成分之一的多糖，在免疫增強劑的研究和應(yīng)用方面，已引起了養(yǎng)殖業(yè)的高度重視。
　　本研究以桔梗多糖為研究對象，進行提取、分離純化，結(jié)構(gòu)分析，并通過體外活性追蹤，篩選出桔梗多糖免疫增強活性的最強部位，為研制新型免疫增強

2、劑提供理論依據(jù)。本研究首先用一步醇沉和分步醇沉法提取桔?？偠嗵呛?個分級多糖，分離純化后對各多糖進行結(jié)構(gòu)分析；然后從它們對雞腹腔巨噬細胞的增殖、吞噬、細胞因子和NO釋放及細胞表面共刺激分子表達的影響，比較了3個桔梗多糖的免疫增強活性，篩選出效果最好的活性部位。
　　采用一步醇沉和分步醇沉法提取粗的桔?？偠嗵牵≒GPStc）和2個分級桔梗多糖PGPS60c和PGPS80c。然后過陰離子交換劑DEAE sephadex A-25柱層析

3、，得到純化的桔梗多糖（PGPS80，PGPS60和PGPSt），分別用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法測定各多糖的糖含量和蛋白含量，采用紅外光譜法（FT-IR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、凝膠滲透色譜（GPC）和核磁共振波譜法（NMR）等方法分析各多糖結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明， PGPS60提取率最高達4.331％，PGPSt的糖含量最高達89.96%，各多糖的蛋白含量都較低。紅外光譜圖顯示，桔梗的3個多糖均具有多糖的典型特征吸收峰；分子量分

4、布顯示，3個多糖均有兩個不同的保留時間，這說明存在兩個對稱的窄峰，表明分子量均一性和生成的多糖純度較高。PGPS80，PGPS60和PGPSt的重均分子量分別為4.14×103~1.01×105 Da，5.69×103~1.12×105 Da和2.05×103~2.67×105 Da；單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，PGPS80主要由葡萄糖（54.322%）、阿拉伯糖（16.801%）、半乳糖（15.013%）組成，PGPS60主要由葡萄糖（62.6

5、03%）、阿拉伯糖（13.925%）組成。PGPSt主要由葡萄糖（55.397%）、甘露糖（22.305%）組成；1H-NMR和13C-NMR圖譜顯示，PGPS80和PGPSt主鏈均由(1→3)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp連接，與單糖組成分析結(jié)果一致。
　　將PGPS80，PGPS60和PGPSt加入到雞腹腔巨噬細胞培養(yǎng)體系中，用MTT法測定其安全濃度；然后將安全濃度下的3個多糖加入到雞腹腔巨噬細胞中，培養(yǎng)4h

6、后加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)44 h后，MTT法測定雞腹腔巨噬細胞增殖變化（最高細胞增殖率）。結(jié)果表明，PGPSt在15.625μg mL-1時的細胞增殖率最高，為132%；其次為PGPS80和PGPS60在15.625μg mL-1時的細胞增殖率分別為128%、117%。
　　采用雞腹腔巨噬細胞吞噬FITC標記的大腸桿菌的方法，檢測雞腹腔巨噬細胞的吞噬活性。將不同濃度的PGPS80，PGPS60和PGPSt加入雞腹腔巨噬細胞中，培養(yǎng)4

7、h后，加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入FITC-E.coli，Triton X-100避光孵育2 h。用細胞刮刀刮下，PBS洗滌后重懸細胞，用流式細胞儀檢測吞噬率。結(jié)果表明，PGPS80，PGPS60和PGPSt均可促進巨噬細胞對FITC標記的E.coli的吞噬能力。在濃度為15.625μg mL-1時，PGPSt可明顯增強巨噬細胞的吞噬率，達到23.04%，其次為PGPS80（19.60%）， PGPS60（16.96%）。

8、>　　Griess法檢測NO釋放。將不同濃度的PGPS80，PGPS60和PGPSt加入雞腹腔巨噬細胞中，培養(yǎng)4h后，加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照NO檢測試劑盒的說明書操作，在酶聯(lián)免疫儀上檢測540 nm處的OD值。結(jié)果表明，PGPS80，PGPS60和PGPSt在濃度為7.813~31.25μg mL-1時，NO的釋放量均明顯高于空白對照組，尤其在15.625μg mL-1時，釋放量最為顯著。
　　將不同濃度的PGPS8

9、0，PGPS60和PGPSt加入雞腹腔巨噬細胞中，培養(yǎng)4 h后，加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照ELISA檢測試劑盒的說明書操作，在酶聯(lián)免疫儀上檢測450 nm處的OD值。結(jié)果表明，在濃度為31.25μg mL-1時，PGPS80，PGPS60和PGPSt組的細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6β分泌均顯著升高。
　　將不同濃度的PGPS80，PGPS60和PGPSt加入雞腹腔巨噬細胞中，培養(yǎng)4 h后，加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)2

10、4 h后，細胞刮刀刮下，用含雞血清的PBS染色緩沖液沖洗后，室溫封閉；加入10μL CD80-FITC（或 CD86-FITC）后重懸細胞，用流式細胞儀檢測相對熒光強度。結(jié)果表明，PGPS80，PGPS60和PGPSt組顯著提高細胞表面分子CD80和CD86的表達水平，濃度在15.625μg mL-1時，PGPSt的CD80和CD86的表達最為顯著，分別增加了3.89倍和3.31倍。
　　綜合比較發(fā)現(xiàn)，PGPSt在濃度為15.62