中藥玉竹提取物對小鼠免疫功能的影響.pdf

1、前言：
　　 玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.)Druee]是百合科黃精屬中草藥,藥用根莖中含有多糖、黃酮、生物堿、甾體皂甙、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強(qiáng)心甙等各類成分,具有多種生物學(xué)活性。中醫(yī)常用于治療肺胃陰傷、燥熱咳嗽、咽干口渴和內(nèi)熱消渴等癥?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究證明玉竹提取物A可抑制免疫功能,對1型糖尿病模型鼠具有明顯的治療作用。此外,玉竹提取物A尚具有抗凝血作用;玉竹提取物B具有抗腫瘤作用;玉竹提取物C(玉竹

2、多糖)具有抗衰老作用,可以延緩衰老模型鼠細(xì)胞及體液免疫功能的衰退;又有實(shí)驗(yàn)證明玉竹醇水提取物毒副作用較低。
　　 在正常機(jī)體中,各種T細(xì)胞亞群相互作用,對免疫系統(tǒng)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié),維持機(jī)體正常的生理功能。其中主要的是CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用更為突出重要。CD4+αβT細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞兩個(gè)功能亞群,Th1細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子干擾素γ(interferongamma,IFN-γ)抑

3、制Th2細(xì)胞的功能,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答(遲發(fā)型超敏反應(yīng)和CTL的特異性靶細(xì)胞)。反之,Th2細(xì)胞通過分泌白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)和白細(xì)胞介素10(IL-10)可下調(diào)抗原提呈細(xì)胞,抑制Th1細(xì)胞增殖和其功能,相對提高體液免疫應(yīng)答。我們發(fā)現(xiàn)玉竹提取物A治療1型糖尿病模型鼠的主要機(jī)制是抑制CD4+Th1細(xì)胞活性,增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能,糾正免疫調(diào)節(jié)功能失衡。
　　 前期實(shí)驗(yàn)己經(jīng)證實(shí)玉竹提取物在一定程度上能刺

4、激小鼠脾臟Th1細(xì)胞增殖,通過分泌細(xì)胞因子IFN-γ抑制Th2細(xì)胞的功能,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。本文旨在進(jìn)一步研究玉竹提取物對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響,探討玉竹提取物對小鼠脾臟αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞的增殖以及CD4+αβT細(xì)胞/CD8+αβT細(xì)胞比值的影響,并揭示其作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)材料：
　　 一、主要試劑
　　 玉竹提取物粉末(中國醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提取),RPMI-1640培養(yǎng)液,胎牛血清,0.01MPBS緩

5、沖液,紅細(xì)胞裂解液,MTT、DMSO、IFN-γ和IL-4EIASA試劑盒和CFSE等。
　　 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 6-8W清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠,購于中國科學(xué)院北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、脾細(xì)胞分離及其懸液的制備
　　 頸椎脫位處死小鼠,常規(guī)制備脾淋巴細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml。
　　 2、MTT比色法和標(biāo)記CFSE檢測對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

6、r>　　 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測玉竹提取物對小鼠脾臟αβT和γδT細(xì)胞增殖及CD4+αβT細(xì)胞/CD8+αβT細(xì)胞比值的影響
　　 4、ELISA法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ以及Th2細(xì)胞分泌的IL-4的水平
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0軟件分析結(jié)果,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、玉竹

7、提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響
　　 (1)經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)玉竹提取物在各濃度范圍內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞均有增殖作用,其中1000νg/ml濃度增殖作用最大(P＜0.01)。沒有發(fā)現(xiàn)玉竹提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒作用。
　　 (2)選擇1000μg/ml的玉竹提取物濃度誘導(dǎo)小鼠脾淋巴增殖,流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖程度顯著高于正常對照組(P＜0.01)。
　　 2、玉竹提取物對

8、小鼠脾臟αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞增殖的影響
　　 采用β和δ熒光抗體標(biāo)記,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的αβT細(xì)胞的數(shù)量顯著高于正常對照組(P＜0.01)。γδT細(xì)胞主要存在于小鼠腸黏膜上皮間和胸腺等部位,脾臟存在的量很少,玉竹提取物激增殖的主要是αβT細(xì)胞。
　　 3、玉竹提取物對小鼠脾臟CD4+αβT細(xì)胞/CD8+αβT細(xì)胞比值的影響
　　 提取小鼠脾淋巴細(xì)胞,與玉竹提取物在37℃5%CO2的條件下培養(yǎng)96

9、h,CD4和CD8熒光抗體染色,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組CD4+αβT細(xì)胞與CD8+αβT細(xì)胞比值低于正常對照組(P＜0.05)。
　　 4、玉竹提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-4產(chǎn)生的影響
　　 通過ELISA檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與正常對照組比較,IFN-γ產(chǎn)生的水平顯著升高(P＜0.01),而對IL-4的產(chǎn)生沒有明顯的影響。
　　 結(jié)論：

10、>　　 1、玉竹提取物在1000μhg/ml濃度時(shí)對小鼠脾臟αβT細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。
　　 2、1000μg/ml的濃度玉竹提取物具有降低小鼠脾臟CD4+αβT細(xì)胞與CD8+αβT細(xì)胞比值的作用,提高CD8+αβT細(xì)胞的數(shù)量。
　　 3、1000μg/ml濃度的玉竹提取物能有效刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IFN-γ,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系;而對IL-4的產(chǎn)生沒有明顯的影響。提示玉竹提取物可能具有提高小鼠脾臟CD8+