益肺活血顆粒對香煙提取物誘導巨噬細胞炎癥反應和氧化應激的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　慢性阻塞性肺疾病簡稱慢阻肺，是一種常見的、可以預防和治療的疾病。迄今對于慢阻肺的發(fā)病機制尚不明確，其中氧化-抗氧化失衡及異常氣道炎癥是慢阻肺的兩大關(guān)鍵環(huán)節(jié)。巨噬細胞是慢阻肺炎癥反應中的主要效應細胞，在慢阻肺炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。香煙煙霧被認為是慢阻肺的主要發(fā)病因素，香煙煙霧可通過激活包括巨噬細胞在內(nèi)的炎性細胞引發(fā)氣道炎癥發(fā)揮生物學效應，此外，巨噬細胞的氧化應激、氧化-抗氧化失衡也參與了慢阻肺的發(fā)生發(fā)展。核轉(zhuǎn)錄因子

2、NF-κB是與炎癥密切相關(guān)的信號通路，NF-κB激活后可分泌大量炎癥介質(zhì)如IL-8和TNF-α等而加重慢阻肺炎癥反應程度。益肺活血顆粒(YFHXG)是董建華院士研制的用于治療慢阻肺的經(jīng)驗用藥，在臨床上應用多年，療效顯著，但YFHXG治療慢阻肺的具體機制尚不明確。因此，本研究從氧化失衡及炎癥失控兩方面出發(fā)，擬用香煙提取物(CSE)刺激巨噬細胞體外模擬COPD氧化應激及慢性炎癥環(huán)境，同時予以YFHXG干預，檢測各組巨噬細胞內(nèi)活性氧簇(ROS

3、)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、IL-8、TNF-α表達及NF-κB活性變化，以期為進一步闡明YFHXG治療慢阻肺的藥理機制提供更多實驗依據(jù)。
　　方法：
　　用佛波酯(PMA)將U937細胞誘導為巨噬細胞，并采用免疫熒光法對巨噬細胞特異性標志CD14進行鑒定;用1.2～9.6g/L的YFHXG及0.5～10％的CSE處理巨噬細胞，于12、24、48h用CCK-8法測定細胞活性;將巨噬細胞分5組：正常細胞組、CSE組、

4、CSE+YFHXG低(1.2g/L)、中(2.4g/L)、高(4.8g/L)濃度組，利用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平，WST-8法檢測細胞內(nèi)SOD活性，ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-8和TNF-α含量，RT-PCR法檢測胞內(nèi)IL-8和TNF-αmRNA水平;檢測YFHXG對NF-κB活性影響實驗部分，共分4組：正常細胞組、CSE組、YFHXG(2.4g/L)+CSE組及小白菊內(nèi)酯(Parthenolide)+CSE組，Western-

5、blot法檢測胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50/p65及p-IκB表達水平;免疫熒光法觀察胞核內(nèi)NF-κB p65及胞漿內(nèi)p-IκB表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.利用PMA成功地將U937細胞誘導分化為巨噬細胞，獲得的巨噬細胞可表達特異性標志CD14;
　　2.針對U937細胞來源的巨噬細胞，確立了合適的CSE濃度為5％，合適的YFHXG濃度區(qū)間為1.2～4.8g/L，合適的作用時間為24h;
　　3.CSE可誘

6、導U937細胞來源的巨噬細胞ROS生成增加，并減少胞內(nèi)SOD活性;YFHXG可逆轉(zhuǎn)CSE誘導的氧化損傷效應;
　　4.CSE可誘導巨噬細胞釋放IL-8及TNF-α，YFHXG可以減輕CSE誘導的巨噬細胞炎性反應，減少炎性介質(zhì)IL-8、TNF-α的表達，
　　5.CSE可誘導巨噬細胞內(nèi)NF-κB活化，YFHXG可抑制巨噬細胞內(nèi)NF-κB活化。
　　結(jié)論：
　　香煙煙霧是導致慢阻肺的重要致病因素，可誘發(fā)慢阻肺巨噬細胞