人巨細(xì)胞病毒誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞自噬與病毒增殖.pdf

1、目的：
　　1.明確THP-1源性巨噬細(xì)胞感染HCMV后，細(xì)胞自噬水平的時序性變化；
　　2.觀察HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后，AIM2炎性體通路下游效應(yīng)因子IL-1β表達(dá)的時序性變化；
　　3.確定HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后，病毒UL122基因的轉(zhuǎn)錄變化；
　　4.探討固有免疫細(xì)胞自噬與AIM2炎性體通路在抗HCMV機(jī)制中的作用。
　　方法：
　　1. THP-1細(xì)胞分化：體外培養(yǎng)

2、THP-1細(xì)胞，用PMA（100 ng/ml）刺激其分化為THP-1源性巨噬細(xì)胞，構(gòu)建HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞模型。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：①HCMV AD169標(biāo)準(zhǔn)毒株感染組（HCMV組）；②熱滅活HCMV感染組（Heat-HCMV組）；③模擬感染對照組（M組）；④雷帕霉素（rapamycin,400 nmol）自噬陽性對照組（RAPA組）。病毒感染復(fù)數(shù)MOI=1。
　　3. THP-1源性巨噬細(xì)胞自噬水平的評估

3、r>　?。?）western blot檢測自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)量和LC3轉(zhuǎn)化量（LC3-II/LC3-I）在感染后1h、3h、6h、12h、24h和48h的動態(tài)變化；
　?。?）用透射電鏡觀察各組細(xì)胞胞質(zhì)中自噬泡形成數(shù)量，以觀察感染后6h、12h和24h自噬泡數(shù)量的變化；
　　4. ELISA法測定THP-1源性巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)的時序性變化：在病毒感染細(xì)胞后1h、3h、6h、12h、24h和48h，收集細(xì)胞培

4、養(yǎng)上清，用ELISA法測定HCMV組、Heat-HCMV組和M組中細(xì)胞上清IL-1β表達(dá)變化，設(shè)立poly(dA:dT)（轉(zhuǎn)染24h）為陽性對照組。
　　5.病毒UL122基因表達(dá)水平：用real-time RT-PCR法定量測定病毒UL122基因感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后1h、3h、6h、12h、24h和48h的轉(zhuǎn)錄水平變化；
　　結(jié)果：
　　1. THP-1源性巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3轉(zhuǎn)化量和beclin1表達(dá)

5、動態(tài)變化：在HCMV感染組，THP-1源性巨噬細(xì)胞感染后1h，自噬相關(guān)蛋白beclin1表達(dá)量明顯增高；LC3轉(zhuǎn)化量在感染后6h明顯增高；而到感染后24h和48h，beclin1表達(dá)量和LC3轉(zhuǎn)化量都降低，明顯低于Heat-HCMV組和RAPA陽性對照組（P<0.05）。當(dāng)用Heat-HCMV處理THP-1源性巨噬細(xì)胞，beclin1在1h就開始明顯高表達(dá)，LC3轉(zhuǎn)化量在6h明顯增高，直到感染后48h持續(xù)高表達(dá)。
　　2. THP

6、-1源性巨噬細(xì)胞自噬泡數(shù)量的變化：HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后6h可觀察到自噬泡數(shù)目明顯增加，但感染后24h明顯降低；而Heat-HCMV處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后6 h自噬泡明顯增加，并持續(xù)到感染后48h；
　　3. THP-1源性巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平變化：HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞1h后，細(xì)胞上清IL-1β表達(dá)量逐漸顯著增高，感染后3h和6h達(dá)到poly(dA:dT)陽性對照組水平（P>0.05），感染

7、后12h、24h和48h明顯高于poly（dA:dT）陽性對照組（P<0.05）。Heat-HCMV組在3h后各時間點(diǎn)IL-1β表達(dá)顯著低于HCMV組（p<0.05）而與模擬感染組無明顯差異（P>0.05）。
　　4. HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后24 h才出現(xiàn)病毒UL122基因轉(zhuǎn)錄量明顯增加，是感染后1h的2.12倍（p<0.05），至48 h達(dá)3.43倍（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. HCMV在感

8、染早期促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，但在感染24h后細(xì)胞自噬受到抑制；而滅活Heat-HCMV可持續(xù)活化細(xì)胞自噬，提示HCMV可通過抑制固有免疫細(xì)胞自噬而逃逸病毒清除；
　　2. HCMV可誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞持續(xù)顯著高表達(dá)IL-1β，而滅活病毒無此作用，表明該效應(yīng)與病毒激活THP-1源性巨噬細(xì)胞AIM2炎性體通路有關(guān)；
　　3.與HCMV高敏感細(xì)胞HEL相比，HCMV感染THP-1源性巨噬細(xì)胞后病毒即刻早期基因