丙酮酸乙酯對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞自噬和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoproteins，ox-LDL)并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，泡沫細(xì)胞大量死亡可導(dǎo)致局部堆積大量脂質(zhì)，斑塊進(jìn)展甚至破裂。細(xì)胞死亡方式包括:自噬性死亡，凋亡和壞死。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)是一種丙酮酸衍生物，多個(gè)研究顯示該藥物能通過(guò)抑制細(xì)胞自噬和凋亡，減少細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮對(duì)臟器的保護(hù)作用。本研究擬觀察EP對(duì)泡沫細(xì)胞

2、自噬和凋亡的影響，并初步探討可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.THP-1源性泡沫細(xì)胞模型的構(gòu)建:用不同濃度ox-LDL(0mg/L～150mg/L)誘導(dǎo)構(gòu)建THP-1源性泡沫細(xì)胞模型。之后用油紅O染色鑒定造模情況，用MTT法測(cè)細(xì)胞生存率。
　　2.ox-LDL刺激對(duì)泡沫細(xì)胞自噬和凋亡的影響:THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)貼壁后，給予不同濃度的ox-LDL(0mg/L～150mg/L)孵育24小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬和

3、凋亡水平，以篩選最佳模型構(gòu)建條件。
　　3.EP對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞自噬及凋亡的影響:用上述研究篩選的最適ox-LDL濃度刺激泡沫細(xì)胞生成，應(yīng)用不同濃度EP(5mM～20mM)進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)泡沫細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的影響。分組如下:①對(duì)照組:不加任何干預(yù)因素;②泡沫細(xì)胞組:加入100mg/L的ox-LDL;③低濃度EP組:加入100mg/L的ox-LDL和5mM的EP;④中濃度EP組:加入100mg/L的ox-LDL和10m

4、M的EP;⑤高濃度EP組:加入100mg/L的ox-LDL和20mM的EP。共同孵育24小時(shí)后，用western blot、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、PCR技術(shù)觀察細(xì)胞自噬水平、細(xì)胞凋亡率。評(píng)估不同濃度EP對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的影響。用免疫熒光、PCR技術(shù)評(píng)估各組HMGB1水平表達(dá)的差異。
　　4.EP對(duì)泡沫細(xì)胞自噬和凋亡影響可能的分子機(jī)制:用免疫熒光、PCR技術(shù)評(píng)估ox-LDL組與ox-LDL+20m

5、MEP組HMGB1、Beclin1、Rage等基因水平表達(dá)的差異，探討EP作用于泡沫細(xì)胞自噬和凋亡水平可能的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.ox-LDL為25mg/L時(shí)，細(xì)胞生存率即下降至87.18％±5.34％（與對(duì)照組比較P＜0.05）。隨著ox-LDL濃度升高，細(xì)胞活力逐漸下降，油紅O染色可見(jiàn)泡沫細(xì)胞內(nèi)大量脂滴。
　　2.THP-1源性泡沫細(xì)胞自噬率及凋亡率水平隨著ox-LDL濃度增高增加，0mgL組，25mg/L組

6、，50mg/L組，100mg/L組，150mg/L組的自噬率分別為0.05％±0.01％,1.28％±0.32％,2.09％±0.17％,5.01％±0.33％,5.41％±0.27％，凋亡率分別為10.01％±0.19％，20.36％±3.42％，29.83％±6.27％，49.29％±10.66％，62.70％±1.95％。但100mg/L組與150mg/L組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)、real

7、-time PCR、Western blot等檢測(cè)手段證實(shí)，隨著EP濃度增高，自噬率、自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平逐漸下降。泡沫細(xì)胞組凋亡率較對(duì)照組明顯增加(48.77％±7.22 VS5.87±1.03)(P＜0.05)。不同濃度EP組(5mM，10mM，20mM)細(xì)胞凋亡率分別為26.12％±3.99％，12.92％±1.32％，9.46％±0.53％，均較泡沫細(xì)胞組明顯下降(P＜0.05)，凋亡標(biāo)志性蛋白caspase-3表達(dá)隨著EP濃

8、度增加而減少。即隨著EP濃度升高，凋亡率下降明顯。
　　4.免疫熒光染色、PCR顯示ox-LDL+20mMEP組HMGB1、Beclin1、Rage和TNF-α基因mRNA表達(dá)水平較ox-LDL組顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1.以PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞24小時(shí)可以促使該細(xì)胞貼壁分化為巨噬細(xì)胞;之后再以ox-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成。方法簡(jiǎn)單可重復(fù)性好。
　　2.在ox-LDL誘導(dǎo)THP-1源性泡沫細(xì)胞中自噬和凋亡