非編碼RNA AsrC對傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞中生存能力的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　近年來，通過計(jì)算機(jī)預(yù)測、寡核苷酸芯片和高通量測序技術(shù)，細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多非編碼RNA(ncRNA)，可以參與細(xì)菌的基因表達(dá)調(diào)控。通過RNA測序我們發(fā)現(xiàn)了傷寒沙門菌(S.Typhi)中由rseC對側(cè)的反義鏈編碼的ncRNA AsrC，并對其分子特性和功能做了初步研究。本文旨在探討傷寒沙門菌中ncRNA AsrC的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)。比較AsrC高表達(dá)菌株(WT+pBAD-as

2、rC)和空質(zhì)粒對照株(WT+pBAD)作用THP-1巨噬細(xì)胞0，12，24 h后的增殖和復(fù)制能力。
　　2.AsrC對靶基因rseC的影響。通過Northern blot和qRT-PCR檢測WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中rseC mRNA的水平。通過自殺質(zhì)粒法構(gòu)建染色體rseC3×Flag融合菌株，將AsrC高表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至融合菌株中，用抗Flag抗體通過Western blot檢測兩者RseC蛋白的表達(dá)水平。

3、
　　3.AsrC對σE(RpoE)的影響及機(jī)制分析。通過Northern blot和qRT-PCR檢測WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中rpoE mRNA的水平，Westernblot檢測兩者RpoE蛋白水平。將高表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒導(dǎo)入rseC缺陷株中，構(gòu)建ΔrseC+pBAD-asrC和ΔrseC+pBAD菌株，通過qRT-PCR和Western blot檢測兩者rpoE mRNA和RpoE蛋白的水平。
　　4.A

4、srC在巨噬細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制分析。通過qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞內(nèi) WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中asrC、rseC和rpoE的表達(dá)水平。Western blot檢測WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中自噬標(biāo)志蛋白LC3的水平。
　　結(jié)果:
　　1.巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， WT+pBAD-asrC菌株胞內(nèi)生存能力低于WT+pBAD菌株。
　　2.Northern blot和qRT-PCR檢測靶基

5、因的mRNA水平，結(jié)果顯示與WT+pBAD相比，WT+pBAD-asrC中rseC mRNA表達(dá)上調(diào)。利用自殺質(zhì)粒法成功構(gòu)建成功構(gòu)建染色體rseC3×Flag融合菌株，Westernblot檢測RseC蛋白，結(jié)果顯示與WT+pBAD相比，WT+pBAD-asrC中RseC蛋白水平明顯增加。
　　3.Northern blot、qRT-PCR和Western blot檢測rpoE表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與WT+pBAD相比，WT+pB

6、AD-asrC中rpoE mRNA以及RpoE蛋白表達(dá)增加，在ΔrseC+pBAD-asrC和ΔrseC+pBAD菌株中rpoEmRNA以及RpoE蛋白無明顯差異。
　　4.感染巨噬細(xì)胞后，qRT-PCR結(jié)果顯示，高表達(dá)AsrC同樣可以增加對側(cè)靶基因rseC mRNA水平，但rpoE無明顯變化。Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3結(jié)果顯示，WT+pBAD-asrC和WT+pBAD LC3的水平無明顯差別。
　　結(jié)論