鼠傷寒沙門菌ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株的構(gòu)建及其對巨噬細(xì)胞的影響.pdf

1、SipB編碼鼠傷寒沙門菌的一種侵襲性蛋白，其與細(xì)菌細(xì)胞膜耐高滲能力有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)腸道的炎癥反應(yīng)，但是有關(guān)對其毒力、免疫功能等生物學(xué)特性方面的報(bào)道較少; CRP是編碼cAMP的受體蛋白，目前已證實(shí)其與細(xì)菌的新陳代謝、碳源的利用等有關(guān)，是沙門菌主要的毒力蛋白，但是對于其是否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的死亡以及影響細(xì)胞糖酵解方面未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過重組自殺性質(zhì)粒pREΔsipB介導(dǎo)的細(xì)菌同源重組技術(shù)在鼠傷寒沙門菌SL1344和SL1344Δcrp的基礎(chǔ)

2、上構(gòu)建出 SL1344ΔsipB和 SL1344ΔcrpΔsipB缺失株，并對它們生物學(xué)特性以及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的死亡和糖酵解等方面進(jìn)行比較，以了解 sipB的基本功能，探討 sipB和 crp基因誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡與糖酵解的關(guān)系，為進(jìn)一步研究減毒沙門菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的糖酵解機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下：
　　1. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　以鼠傷寒沙門菌 SL1344為模板，擴(kuò)增出 s

3、ipB基因的上下游片段 sipB1和sipB2，分別將 sipB1和 sipB2亞克隆到中間載體 pBluescriptSK(+)，再將上下游的融合片段克隆到自殺性質(zhì)粒 pRE112中，構(gòu)建出重組自殺性質(zhì)粒pRE112ΔsipB。最后以攜帶重組自殺性質(zhì)粒的大腸桿菌χ7213（pRE112ΔsipB）為供體菌，分別以鼠傷寒沙門菌 SL1344和 SL1344Δcrp為受體菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，通過兩步法篩選出SL1344ΔsipB和SL1344

4、ΔcrpΔsipB缺失菌株。
　　2. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株的生物學(xué)特性檢測
　　通過對缺失菌株和親本菌株進(jìn)行生化特性、生長曲線、遺傳穩(wěn)定性、運(yùn)動性、生物被膜形成能力、體內(nèi)外的侵襲能力以及對小鼠毒力等方面進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：SL1344ΔsipB缺失株在生化特性、生長特性、運(yùn)動性以及生物被膜形成等方面與親本菌株一致；SL1344ΔcrpΔsipB雙缺失株的生化特性與 SL1344Δcrp仍保持一致

5、，與親本菌株相比其生化特性發(fā)生了變化，生長速度發(fā)生了減慢，運(yùn)動性和生物被膜形成能力均發(fā)生了降低；小鼠毒力以及體內(nèi)外的侵襲能力等方面缺失株和親本株相比均發(fā)生了顯著的降低（P<0.05）；但是均能夠不同程度的刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，ΔsipB、ΔcrpΔsipB、Δcrp三株缺失株免疫后對100LD50親本菌株的攻毒分別能提供50％、60%和90%左右的免疫保護(hù)效力。以上結(jié)果表明 sipB是沙門菌的一個免疫原性基因，而 crp有潛力作為疫

6、苗缺失菌株的候選基因。
　　3. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株引起巨噬細(xì)胞死亡的檢測
　　將不同沙門菌感染巨噬細(xì)胞 RAW264.7后分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和 ELISA方法對細(xì)胞死亡情況和Caspase-1,3,8,9的酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：親本菌株感染細(xì)胞死亡率顯著高于缺失組（P<0.05）；Caspase-1、Caspase-8和 Caspase-9的活性在感染后各個時間點(diǎn)缺失株組均低于親本株組（P

7、<0.05），而 Caspase-3在感染4 h后缺失株組均低于親本株組（P<0.05）。表明不同沙門菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的能力不同，均是通過先激活Caspase-1,8,9再激活Caspase-3的途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡。
　　4. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株感染巨噬細(xì)胞糖酵解的檢測
　　將不同沙門菌感染巨噬細(xì)胞后不同時間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行丙酮酸、乳酸、ATP含量以及已糖激酶（HK）活性的檢測。結(jié)果表明：不同時