鼠傷寒沙門菌spvb.spvc基因共同缺陷變異株的構(gòu)建及spvb、spvc基因?qū)χ卸景Y狀、免疫功能的影響

1、 分類號： 密級： UDC： 學(xué)號：416522712050 南 昌 大 學(xué) 專 業(yè) 學(xué) 位 研 究 生 學(xué) 位 論 文 鼠傷寒沙門菌 鼠傷寒沙門菌 spvB.spvC 基因共同缺陷變異株的構(gòu)建 基因共同缺陷變異株的構(gòu)建及 spvB、spvC 基因?qū)χ卸景Y狀、免疫功能的影響 基因?qū)χ卸景Y

2、狀、免疫功能的影響 Construction of spvB. spvC Gene-Deleted Mutants in Salmonella Typhimurium and its function on Symptoms and immune Response 劉曉艷 培養(yǎng)單位（院、系） ：江西省兒童醫(yī)院 指導(dǎo)教師姓名、職稱：陳強(qiáng) 教授 主任醫(yī)師 專業(yè)學(xué)位種類：臨床醫(yī)學(xué) 專業(yè)領(lǐng)域名稱：兒科學(xué) 論文答辯日期：2015 年 5 月 答辯

3、委員會(huì)主席： 吳星恒 評閱人： 陳 曉 胡龍華 2015 年 5 月摘要 II 摘 要 目的 目的： 實(shí)驗(yàn)組前期已構(gòu)建鼠傷寒沙門菌 spvB/spvC 基因缺陷株， 故本研究僅構(gòu)建鼠傷寒沙門菌 spvB.spvC 基因共同缺陷株， 并將野生菌株與這三株缺陷變異株感染小鼠，觀察分析 spvB/spvC 基因?qū)χ卸景Y狀、免疫調(diào)節(jié)功能的影響。為研究鼠傷寒沙門菌 spvB/spvC 毒力基因的致病

4、機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)， 并為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究該基因的功能及疫苗的制備提供工具和手段。 方法 方法： 1. 同源重組法制備鼠傷寒沙門菌 spvB.spvC 基因共同缺陷株。在 GeneBank數(shù)據(jù)庫中查出鼠傷寒沙門菌毒力基因 spv 序列（包括 spvABCD） ，給 spvB、spvC設(shè)計(jì)兩對特異性引物，并在引物的 5’末端加上酶切位點(diǎn)，PCR 法擴(kuò)增 spvB 基因上游及 spvC 基因下游的核苷酸片段后，連接至自殺質(zhì)粒 pC

5、VD442（pCVD442-ΔspvB.spvC） 。再將 pCVD442-ΔspvB.spvC 入感受態(tài)細(xì)菌 SM10 λpir 內(nèi)，按接合轉(zhuǎn)移法使 pCVD442-ΔspvB.spvC 導(dǎo)入野生型鼠傷寒沙門菌 211 （spvB+.spvC+） 中，隨后蔗糖誘導(dǎo)同源重組。用 PCR 擴(kuò)增來觀察重組情況，將穩(wěn)定的完全重組株認(rèn)為是 spvB.spvC 基因共同缺陷變異株，并送基因測序鑒定。 2. 沙門菌 spvB/spvC 基因?qū)χ卸景Y

6、狀、免疫調(diào)節(jié)功能影響的研究。所有BALB/c 小鼠均給予自由進(jìn)食、飲水，室溫（20℃-22℃） ，濕度（50%-55%）飼養(yǎng)。隨機(jī)分為 PBS 組、野生型沙門菌 211(Samonella typhimurium，STM.211)組、敲除 spvB 基因的沙門菌（STM.211-ΔspvB）組、敲除 spvC 基因的沙門菌（STM.211-ΔspvC）組和同時(shí)敲除 spvB.spvC 基因的沙門菌（STM.211-ΔspvB.spvC）

7、 組， 每組 25 只。 PBS 組經(jīng)腹腔注射 （intraperitoneal， i.p.） 0.2ml PBS，其余各組分別注射 0.2ml 105CFU 的 STM.211、STM.211-ΔspvB、STM.211-ΔspvC、STM.211-ΔspvB.spvC。造模完成后觀察小鼠精神狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)情況、腹瀉、體重、毛發(fā)改變等感染中毒癥狀，于感染后 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，每組隨機(jī)取 5 只小鼠摘眼球取血，用 EL