傷寒沙門菌sufC基因及t4606基因的生物學功能分析.pdf

1、目的:
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌sufC及t4606基因的表達受兩個重要的調(diào)節(jié)因子RpoE和RpoS的雙重調(diào)控，推測其可能在傷寒沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用。sufC在其他腸道致病菌中對鐵離子的轉(zhuǎn)運至關重要，參與細菌對抗宿主細胞的氧化應激；傷寒沙門菌t4606基因編碼一未知功能的蛋白質(zhì)，對其基因序列分析發(fā)現(xiàn)具有Patatin-like phospholipase的功能基序，本研究旨在對sufC基因及t4606基因在傷寒沙門

2、菌中的功能進行鑒定，揭示兩者在傷寒沙門菌致病過程中的作用。
　　方法:
　　一、傷寒沙門菌sufC功能研究
　　(1) sufC基因缺陷變異株的制備：用特異性引物擴增帶有sufC基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段,將其電轉(zhuǎn)至含pKD46的傷寒沙門菌野生株，利用λ-Red系統(tǒng)制備sufC的基因缺陷株。
　　(2) sufC基因缺陷回補株的制備：構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-sufC，將其及pACYC184空質(zhì)粒

3、導入sufC基因缺陷株，制備sufC基因的缺陷回補株及空質(zhì)?；匮a對照株。
　　(3)生長曲線的測定：分別測定S. Typhi野生株、sufC基因缺陷株、sufC基因缺陷回補株和空質(zhì)?；匮a對照株在正常條件、高滲應激、酸和氧應激條件下的生長曲線，比較各菌株的生長差異。
　　(4) sufC基因缺陷株的上皮細胞侵襲實驗：將傷寒沙門菌野生株、sufC基因缺陷變異株及其回補株和空質(zhì)?；匮a對照株培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD6000.4），分別

4、感染HeLa細胞（MOI均為10），分析各菌株對上皮細胞侵襲力的差異。
　　(5) sufC基因缺陷株在巨噬細胞內(nèi)的生存實驗：將傷寒沙門菌野生株、sufC基因缺陷變異株及其回補株和空質(zhì)?；匮a對照株培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD6000.4），分別感染THP-1巨噬細胞（MOI均為10），比較各菌株在巨噬細胞內(nèi)的生存能力差異，同時在細菌感染巨噬細胞的不同時間點測定上清液中巨噬細胞相關細胞因子的表達水平。
　　二、傷寒沙門菌t4606基

5、因功能研究
　　(1) t4606基因缺陷變異株的制備：構(gòu)建t4606基因缺損型同源核苷酸片段，采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導的同源重組方法制備傷寒沙門菌t4606缺陷變異株。
　　(2) t4606基因缺陷回補株的制備：構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD-t4606，將其及空質(zhì)粒pBAD分別導入t4606基因缺陷變異株，制備sufC基因缺陷回補株和空質(zhì)粒回補對照株。
　　(3)生長曲線測定：測定S. Typhi野生株、t4606基

6、因缺陷株、t4606基因缺陷回補株、空質(zhì)?；匮a對照株在普通條件、高滲應激、酸應激和氧應激條件下的生長曲線，比較各菌株的生長差異。
　　(4) t4606基因缺陷株的上皮細胞侵襲實驗,方法同上述傷寒沙門菌t4606基因缺陷株的上皮細胞侵襲實驗。
　　(5) t4606基因缺陷株在巨噬細胞內(nèi)生存實驗，方法同上述傷寒沙門菌t4606基因缺陷株的胞內(nèi)生存實驗。
　　結(jié)果：
　　(1)經(jīng)PCR及序列分析驗證，成功制備了傷寒

7、沙門菌sufC、t4606基因缺陷株及其回補株和空質(zhì)粒回補對照株。
　　(2)生長曲線表明，sufC缺陷株在普通條件和高滲應激條件下與野生株的生存能力無明顯差異，而在氧應激條件下，sufC缺陷株的生長明顯遲緩于野生株，回補sufC基因至sufC缺陷株后，回補株的生長恢復至野生株水平。
　　(3)與野生株相比，sufC缺陷株對上皮細胞的侵襲力明顯減弱。
　　(4)與野生株相比，sufC缺陷株在巨噬細胞內(nèi)的生存能力明顯減弱

8、；野生株與sufC缺陷株感染巨噬細胞后，細胞培養(yǎng)上清中均有細胞因子TNF和IL-6的表達，但在sufC缺陷株中TNF和IL-6的表達水平均明顯低于野生株。
　　(5)在普通生長條件和氧應激條件下，t4606的缺失對傷寒沙門菌的生長無影響，但在高滲應激條件下，t4606缺陷株的生長明顯遲緩于野生株，回補t4606基因至t4606缺陷株后，回補株的生長恢復至野生株水平。
　　(6)與野生株相比，t4606缺陷株在巨噬細胞內(nèi)的生存

9、能力及其對hela細胞的侵襲力無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　通過兩種細菌基因缺失制備系統(tǒng)，我們成功制備了傷寒沙門菌sufC和t4606基因缺陷株及其回補株和空質(zhì)?；匮a對照株。本研究表明，sufC基因有助于傷寒沙門菌在氧應激環(huán)境下的生長，促進傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的存活，且明顯增強傷寒沙門菌對上皮細胞的侵襲力，提示sufC基因?qū)τ趥抽T菌在致病過程中的侵襲和胞內(nèi)生存兩個關鍵環(huán)節(jié)具有重要的促進作用。同時，t4606基因促進傷寒