傷寒沙門菌QseC特性與功能研究.pdf

1、目的:
　　 QseC是大腸桿菌中一個重要的群體感應調節(jié)因子,在信號分子AI-3及腎上腺素／去甲腎上腺素的作用下可以啟動一系列基因的表達。基因組序列分析顯示,傷寒沙門菌中存在有qseBC同源基因,本研究擬觀察傷寒沙門菌qseC同源基因的功能及在是否含有葡萄糖條件下對基因表達的系統(tǒng)調節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1.基因缺陷變異株的制備:采用自殺質粒pGMB151介導的同源重組方法,制備傷寒沙門菌qseB、qseC

2、同源基因的單缺陷及qseB／qseC雙缺陷變異株。
　　 2.qseB、qseC基因缺陷回補株的構建:PCR擴增目的基因,與表達載體pBAD／gⅢ定向連接后,轉化到大腸埃希菌DH5α中篩選陽性質粒,經(jīng)序列分析鑒定后,轉入相應的基因缺陷變異株中。
　　 3.生長曲線的測定:以生長時間為橫坐標,細菌OD600值為縱坐標繪制野生株與缺陷株生長曲線。
　　 4.動力試驗分析:分別在是否含有0.5％葡萄糖的LB半固體培養(yǎng)基

3、中培養(yǎng)細菌,觀察野生株及缺陷株的動力情況。
　　 5.傷寒沙門菌基因表達譜分析:分別在是否含有葡萄糖的條件下培養(yǎng)野生株與qseC基因缺陷變異株至OD600值為1.0,收集菌體、提取總RNA、反轉錄成cDNA并標記熒光(cy3或cy5),與傷寒沙門菌全基因組芯片雜交,雙通道掃描后根據(jù)熒光信號分析各基因轉錄表達水平,比較傷寒沙門菌野生株和qseC基因缺陷變異株基因表達譜差異。
　　 6.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分

4、析:選擇基因芯片結果中部分差異表達基因,設計特異性引物,進行反轉錄和實時定量PCR,驗證DNA芯片分析結果。
　　 7.HeLa細胞侵襲試驗:將在含0.5％葡萄糖生長條件下培養(yǎng)至OD600為1.0左右的細菌,加入培養(yǎng)有HeLa細胞的24孔板中(MOI=20),90 min后收集一部分細胞,加入裂解液,涂LB平板過夜培養(yǎng),計細菌克隆數(shù),代表細菌粘附細胞水平T0；另一部分加入慶大霉素殺死胞外細菌,繼續(xù)培養(yǎng)90 min,破胞后涂板過夜

5、培養(yǎng),計克隆數(shù)代表細菌的侵襲水平T90,用T90／T0的值代表細菌的侵襲力。
　　 結果:
　　 1.經(jīng)PCR及序列分析證實qseB、qseC及qseB／qseC基因缺陷變異株中分別缺失了264,690及954個堿基,表明成功構建傷寒沙門菌qseB、qseC及qseB／qseC基因缺陷變異株。
　　 2.PCR及序列分析結果表明,成功構建pBAD-qseB及pBAD-qseC陽性重組載體,并成功將重組載體導入相應

6、的缺陷株中,制備成qseB、qseC各基因缺陷回補株。
　　 3.生長曲線結果表明qseC基因缺陷變異株在是否含有葡萄糖條件下生存能力均與野生株相似。在葡萄糖條件下,野生株與缺陷株的生長均比不加葡萄糖條件下快。
　　 4.動力試驗結果顯示,在是否含有葡萄糖情況下,qseC基因缺陷變異株動力均比野生株明顯下降,回補qseC基因后動力有所恢復；qseB缺陷變異株與qseB／qseC雙缺陷變異株動力與野生株相比均無明顯差異。<

7、br>　　 5.基因芯片分析結果顯示,在普通條件下,傷寒沙門菌qseC基因缺陷變異株相比野生株,有13個基因表達上調,6個基因表達下調,主要涉及qseC側翼基因、酶類基因等；在含葡萄糖條件下,qseC基因缺陷變異株中有26個基因表達上調,14個基因表達下調,差異表達基因包括SPI-1相關基因,qseC側翼基因,酶類基因等。
　　 6.實時熒光定量PCR分析基因表達差異結果,一方面進一步支持了基因芯片分析結果,另一方面還顯示Qs