LED209阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC群體感應系統(tǒng)體內(nèi)抗感染作用機理研究.pdf

1、目的：抗生素的濫用導致了多重耐藥細菌和泛耐藥細菌的大量出現(xiàn)和蔓延，已成為危害人類健康的嚴重災難，也是當前公共衛(wèi)生領域各國政府高度關(guān)注的焦點。由于抗生素在應用過程中會不可避免地誘導細菌耐藥，新抗生素用于臨床后細菌很快就會產(chǎn)生耐藥，因此傳統(tǒng)抗生素的研制并不能從根本上解決細菌耐藥問題。而且抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠遠超過了新抗生素研發(fā)的速度，臨床有效的抗菌藥物日趨減少。因此，研發(fā)不易誘導耐藥新型抗菌藥物是抗感染藥物研究領域當務之急的研究目

2、標。
　　細菌群體感應系統(tǒng)（QSS）在細菌毒力因子表達調(diào)控、耐藥性產(chǎn)生、生物膜形成、休眠體形成和免疫逃逸等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。阻斷細菌QSS可以抑制其毒力和致病力，而不直接影響細菌的生長或活力，細菌不會受到較強的選擇性生存壓力，因此不易導致耐藥性的快速產(chǎn)生。因此，以QSS為靶點的群體感應抑制劑（QSI）的研究倍受重視，成為新型抗菌藥物研發(fā)領域的新方向。
　　QseC是廣泛存在于革蘭氏陰性細菌表面的群體感應系統(tǒng)，至少25種

3、重要致病細菌表達QseC，這些QseC具有較高同源性，參與調(diào)控細菌毒力、侵襲力和致病性。Rasko等通過對化合物庫進行高通量篩選，首次獲得了一種選擇性作用于QseC的抑制劑LED209，并證實LED209在體外能抑制細菌毒力基因表達，體內(nèi)能顯著降低感染鼠傷寒沙門氏菌或土拉熱弗朗西絲菌的小鼠的死亡率和臟器荷菌量。然而，目前所知包括 LED209在內(nèi)的所有群體感應抑制劑在體外均無殺菌和抑菌作用，但在感染動物體內(nèi)卻能發(fā)揮有效的抗感染保護效應，

4、迄今為止，這一現(xiàn)象的內(nèi)在規(guī)律和作用機理幾乎完全不清楚。前期的研究顯示，阻斷細菌QSS可以調(diào)控感染小鼠體內(nèi)多種細胞因子的分泌水平，提示機體天然免疫系統(tǒng)可能參與了 QSI的抗感染保護效應。因此，推測QseC抑制劑LED209進入機體后，很可能通過某種機制啟動了機體天然免疫抗菌應答效應，繼而殺滅和清除體內(nèi)細菌。本課題針對上述未知問題和我們的推測，選擇臨床感染較為常見、耐藥率高的鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium, S

5、. Typhimurium）作為研究對象，構(gòu)建QseC群體感應系統(tǒng)缺失的qseC敲除株，并利用QseC特異性抑制劑LED209作為工具藥，揭示阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC，或者敲除qseC基因后，何種免疫細胞參與體內(nèi)抗感染保護效應，探索免疫細胞與抗感染保護效應的內(nèi)在聯(lián)系和分子機理。
　　方法：
　　1.構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌qseC基因敲除株△qseC。采用RED同源重組技術(shù)，根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌 qseC基因（GenBank Nu

6、mber:NC_003197.2）的上下游序列和質(zhì)粒 pKD3的氯霉素抗性序列（Cm），設計三對特異性引物，分別用于擴增qseC基因上下游同源臂和氯霉素抗性片段。通過融合PCR實驗，將三個片段連接為線性打靶DNA。將線性打靶DNA電轉(zhuǎn)入含有pKD46質(zhì)粒的鼠傷寒沙門氏菌感受態(tài)，篩選氯霉素陽性單克隆，即為qseC基因替換為氯霉素抗性的菌株。最后通過pCP20表達FLP重組酶，刪除FRT位點間的氯霉素抗性序列，即可得到無抗性的鼠傷寒沙門氏菌

7、qseC敲除株△qseC。
　　2. LED209對體外培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌生長的影響。采用微量稀釋法檢測LED209對鼠傷寒沙門氏菌的最低抑菌濃度（MIC）。用全自動生長曲線分析儀測定細菌培養(yǎng)液的吸光度（OD600），觀察LED209在5 nM、500 nM和50μM濃度范圍內(nèi)，以及敲除qseC基因后對細菌生長的影響，以左氧氟沙星作為陽性對照抗生素，繪制細菌生長曲線。
　　3. LED209對鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠的保護作用

8、。BALB/c小鼠隨機分為野生型鼠傷寒沙門氏菌感染組（WT）、qseC敲除株感染組（ΔqesC）和LED209處理組。分別給小鼠腹腔注射WT或ΔqesC菌液1.0×108 CFU，構(gòu)建小鼠膿毒癥模型。LED209處理組分別于感染前、感染后3小時灌胃給予LED20920 mg/kg。記錄上述各組小鼠感染后48小時內(nèi)生存情況，繪制生存曲線。于感染后20小時，取部分肝臟、脾臟勻漿后涂布于瓊脂平板，計數(shù)細菌CFU。制備感染小鼠肝臟、脾臟病理切片

9、，HE染色后評價各組感染小鼠臟器病理損傷。分離感染小鼠肝臟、脾臟中的鼠傷寒沙門氏菌，使用熒光定量PCR法檢測其重要毒力因子的mRNA表達水平。
　　4.清除小鼠體內(nèi)巨噬細胞對LED209體內(nèi)抗感染作用的影響。仿文獻給予BALB/c小鼠腹腔注射200μL濃度為5 mg/mL的氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（clodronate-liposomes），清除小鼠體內(nèi)巨噬細胞。在注射后24小時進行感染，記錄各組小鼠感染后48小時內(nèi)生存情況，計數(shù)感染后2

10、0小時小鼠肝臟、脾臟內(nèi)細菌CFU，評價清除巨噬細胞后對LED209小鼠體內(nèi)抗感染效果的影響。
　　5.阻斷QseC系統(tǒng)調(diào)控巨噬抗菌應答效應的機理
　　5.1仿文獻分離 BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞，建立巨噬細胞和鼠傷寒沙門氏菌體外共培養(yǎng)模型。感染后1小時，拍照記錄感染后巨噬細胞形態(tài)，并收集巨噬細胞培養(yǎng)上清，進行LDH檢測，計算巨噬細胞死亡率。受感染巨噬細胞進行DAPI和PI雙染，計算PI陽性細胞的百分率以評價巨噬細胞膜完整性

11、和死亡率。
　　5.2使用RIPK1特異性抑制劑Nec-1或caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk預處理巨噬細胞后進行感染，感染后1小時收集細胞上清檢測LDH釋放量，計算巨噬細胞死亡率。
　　5.3巨噬細胞感染后指定時間點，提取上清蛋白檢測caspase-1和IL-1β活化形式的表達水平，并使用ELISA檢測上清IL-1β的釋放量，評價阻斷QseC對感染后巨噬細胞炎性復合體活化的影響。
　　5.4鼠傷寒沙

12、門氏菌感染小鼠后8小時，收集小鼠血清和腹腔灌流液，ELISA檢測IL-1β的分泌量。獲取感染后小鼠腹腔細胞，使用PI和F4/80抗體標記后進行流式細胞儀分析，計算雙陽性細胞百分率，評價感染后小鼠腹腔巨噬細胞的焦亡率。提取感染后小鼠腹腔巨噬細胞總蛋白，檢測caspase-1和IL-1β活化形式的表達水平，評價阻斷QseC對感染后體內(nèi)巨噬細胞炎性復合體活化的影響。
　　5.5使用siRNA沉默巨噬細胞NLRP3和NLRC4炎性復合體后

13、進行感染，1小時后收集細胞上清檢測LDH含量，計算巨噬細胞焦亡率。使用DAPI和PI雙染后計算PI陽性細胞的百分率。western blotting檢測沉默NLRC4炎性復合體后受感染巨噬細胞caspase-1和IL-1β活化形式的表達水平，ELISA檢測上清中IL-1β的釋放量。
　　5.6鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細胞后1、8和16小時，使用1％ Trition X-100裂解細胞，裂解液梯度稀釋后涂布瓊脂平板計數(shù)胞內(nèi)存活細菌的C

14、FU。
　　5.7鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細胞后8小時，實時定量PCR檢測NADPH氧化酶和iNOS的表達水平。收集細胞培養(yǎng)上清，檢測過氧化氫和一氧化氮的含量。評價阻斷QseC對感染后巨噬細胞活性氧和活性氮表達及合成的影響。
　　5.8使用iNOS抑制劑L-NMMA和NADPH氧化酶抑制劑DPI預處理巨噬細胞后進行感染，計數(shù)胞內(nèi)細菌 CFU，評價阻斷 QseC后對巨噬細胞活性氧和活性氮殺菌能力的影響。
　　5.9于LB培

15、養(yǎng)基中加入過氧化氫或亞硝酸鈉，每2小時取菌液梯度稀釋后涂布瓊脂平板，計數(shù)細菌 CFU，評價阻斷 QseC后細菌對活性氧和活性氮殺傷的敏感性。
　　5.10氯喹抵抗實驗：氯喹處理細胞后，會在SCV中積累并最終殺死SCV中的細菌。通過比較氯喹處理與否的胞內(nèi)細菌CFU，評價阻斷QseC對于細菌SCV的影響。
　　5.11溶酶體轉(zhuǎn)運實驗：用生物素標記細菌，預先使親和素標記的辣根過氧化物酶轉(zhuǎn)運到巨噬細胞溶酶體，通過檢測吸光度評價溶酶體

16、與細菌的融合能力。
　　5.12給予感染小鼠腹腔注射 caspase-1特異性抑制劑 Ac-YVAD-cmk或活性氧活性氮抑制劑DPI，記錄感染小鼠生存率和生存時間，計數(shù)感染小鼠肝臟、脾臟細菌CFU。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌qseC敲除株△qseC。通過 RED同源重組技術(shù)構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌 qseC基因敲除株△qseC，經(jīng) PCR鑒定及測序鑒定，確證鼠傷寒沙門氏菌qseC基因已被成功敲除。

17、　　2. LED209不影響體外培養(yǎng)細菌的生長。MIC結(jié)果顯示，256μg/mL的LED209未表現(xiàn)出抑菌或殺菌作用。LED209在5 nM~50μM濃度范圍內(nèi)對細菌生長曲線無明顯影響。qseC缺失菌株的生長情況與野生型菌株也無顯著差異。表明阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC或者敲除其qseC基因，均對細菌生長無明顯影響。
　　3. LED209在感染小鼠體內(nèi)能夠發(fā)揮抗感染保護效應。WT鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠在48小時內(nèi)全部死亡，而LED

18、209處理組感染后48小時仍有50%小鼠存活，ΔqesC菌株感染小鼠在感染后48小時全部存活。與WT菌感染組相比，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組小鼠肝臟、脾臟細菌菌落數(shù)顯著減少，且臟器病理損傷顯著減輕。實時定量PCR結(jié)果顯示，LED209處理組和ΔqesC菌株在感染小鼠體內(nèi)致病相關(guān)毒力因子flhDC、sifA和sopB的表達顯著降低。上述結(jié)果確證，LED209在體內(nèi)能夠發(fā)揮有效的抗感染作用。
　　4.巨噬細胞參與介導了L

19、ED209體內(nèi)抗感染保護效應。為了明確 LED209體內(nèi)抗感染保護效應與何種免疫細胞相關(guān)，我們先用氯膦酸脂質(zhì)體清除小鼠體內(nèi)巨噬細胞，然后進行感染。結(jié)果顯示，LED209體內(nèi)抗感染保護效應顯著減弱，小鼠存活率由50%降低至10%，ΔqesC菌株感染小鼠的存活率則由100%降低至30%，肝臟、脾臟荷菌量顯著升高。上述結(jié)果表明，巨噬細胞參與介導了LED209體內(nèi)抗感染保護效應。
　　5. LED209能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌感染所致的巨噬

20、細胞死亡。在巨噬細胞和鼠傷寒沙門氏菌體外共培養(yǎng)模型上觀察發(fā)現(xiàn)，WT菌株感染后1小時，大量巨噬細胞發(fā)生腫脹、破膜和死亡，而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細胞形態(tài)完好，與未感染對照組無明顯差異。LDH檢測結(jié)果顯示，在WT菌株感染后1小時，60%以上受感染感染巨噬細胞發(fā)生死亡，而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組僅有10%的巨噬細胞發(fā)生死亡。DAPI和PI雙染結(jié)果顯示，WT菌株感染后1小時，巨噬細胞PI陽性百分率顯著升高，

21、而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細胞PI陽性百分率顯著低于WT菌株感染組。以上結(jié)果表明，LED209阻斷QseC能夠顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導巨噬細胞死亡的效應。
　　6.鼠傷寒沙門氏菌感染誘導的巨噬細胞死亡屬焦亡，LED209可抑制受感染巨噬細胞焦亡的發(fā)生。近期研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌感染可以誘導巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡和焦亡。壞死性凋亡可以被RIPK1特異性抑制劑necrostatin-1（Nec-1）阻斷；焦

22、亡則可以被caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk阻斷。分別用Nec-1或Ac-YVAD-cmk預處理巨噬細胞，然后用細菌感染細胞，感染后1小時收集細胞上清檢測LDH釋放量。結(jié)果顯示，Ac-YVAD-cmk預處理則可以顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導的巨噬細胞死亡。表明鼠傷寒沙門氏菌感染誘導的巨噬細胞死亡方式為焦亡，LED209阻斷QseC能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導的巨噬細胞焦亡。
　　7.鼠傷寒沙門氏菌感染誘導的巨

23、噬細胞快速焦亡由 NLRC4炎性復合體介導， LED209阻斷細菌QseC能夠抑制NLRC4-caspase-1-IL-1β信號通路活化，繼而抑制巨噬細胞發(fā)生焦亡。進一步探討阻斷細菌QseC如何抑制受感染巨噬細胞發(fā)生焦亡，在體外細菌和巨噬細胞共培養(yǎng)模型以及膿毒癥模型小鼠上觀察炎性復合體信號通路的活化情況。體外結(jié)果顯示，WT菌株感染組巨噬細胞caspase-1和IL-1β活化形式的表達水平顯著增加，分泌至上清中IL-1β的濃度顯著升高，表

24、明WT菌株感染誘導了巨噬細胞炎性復合體的激活。而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細胞caspase-1和IL-1β活化形式的表達水平與未感染時相比無顯著差異，培養(yǎng)液上清中的IL-1β濃度也無明顯升高。體內(nèi)結(jié)果顯示，WT菌株感染組小鼠腹腔巨噬細胞焦亡率、腹腔巨噬細胞caspas-1和IL-1β活化形式的表達水平以及小鼠血清和腹腔灌流液中IL-1β的分泌量均顯著高于LED209處理組和ΔqesC菌株感染組小鼠。
　　用si

25、RNA分別沉默巨噬細胞NLRP3或NLRC4炎性復合體，然后以細菌感染細胞，檢測培養(yǎng)上清中LDH釋放量，并計算巨噬細胞焦亡率。結(jié)果顯示，沉默NLRC4炎性復合體后，受感染巨噬細胞焦亡率和PI陽性百分率顯著降低，caspase-1和IL-1β活化形式的表達水平顯著降低，培養(yǎng)上清中IL-1β的濃度顯著降低，表明NLRC4炎性復合體參與介導了感染誘導的巨噬細胞焦亡。
　　進一步檢測能夠活化NLRC4的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛基因flhDC的表

26、達及其功能，結(jié)果顯示，LED209阻斷QseC后鼠傷寒沙門氏菌flhDC基因表達水平顯著降低，細菌鞭毛動力顯著減弱。結(jié)果提示，LED209可能通過阻斷 QseC，抑制鼠傷寒沙門氏菌鞭毛基因flhDC的表達，進而抑制NLRC4炎性復合體活化，最終抑制巨噬細胞的焦亡。
　　8. LED209能夠促進巨噬細胞內(nèi)細菌的清除。上述結(jié)果表明LED209通過阻斷QseC，進而抑制感染誘導的巨噬細胞焦亡，那么被巨噬細胞吞噬進入胞內(nèi)的細菌命運又如何

27、呢？研究結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細胞后1小時，WT菌株感染組、LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細胞內(nèi)細菌CFU無顯著性差異，表明巨噬細胞對三組細菌的吞噬能力沒有差異。感染后8和16小時，WT菌株感染組細胞內(nèi)細菌的CFU呈現(xiàn)時間依賴性升高，表明細菌在巨噬細胞內(nèi)持續(xù)增殖。而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組胞內(nèi)細菌CFU在感染后8、16小時則表現(xiàn)為時間依賴性減少，表明LED209阻斷QseC或敲除qseC基因后，可

28、以促進巨噬細胞對胞內(nèi)細菌的清除。
　　9. LED209能夠增強細菌對活性氧和活性氮殺傷的敏感性。進一步探討阻斷細菌QseC或敲除qseC基因為何能促進巨噬細胞胞內(nèi)殺菌，檢測與巨噬細胞胞內(nèi)殺菌相關(guān)的活性氧和活性氮相關(guān)酶的表達水平和含量變化。結(jié)果顯示，巨噬細胞內(nèi)NADPH氧化酶的三個重要亞基gp91phox、p22phox、p47phox以及iNOS的表達水平，上清中一氧化氮和過氧化氫的含量，在三個感染組間均無顯著差異。表明阻斷細菌

29、QseC或敲除qseC基因不影響感染后巨噬細胞活性氧和活性氮的合成。
　　使用iNOS抑制劑L-NMMA和NADPH氧化酶抑制劑DPI預處理巨噬細胞，然后對其進行感染，計數(shù)胞內(nèi)細菌CFU。結(jié)果顯示，DPI和L-NMMA預處理后，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細胞胞內(nèi)活菌數(shù)顯著增多，表明巨噬細胞對阻斷QseC或敲除qesC的鼠傷寒沙門氏菌的清除能力降低。
　　在LB培養(yǎng)基中加入外源性過氧化氫或亞硝酸鈉，每2小時計

30、數(shù)細菌CFU。結(jié)果顯示，在過氧化氫或亞硝酸鈉的作用下，WT組細菌的增殖被顯著抑制，而LED209處理組和ΔqesC組的活菌數(shù)與初始菌量相比出現(xiàn)下降趨勢。上述結(jié)果表明，阻斷QseC或敲除qesC后，細菌對氧和活性氮殺傷的抵抗性顯著降低，更容易被巨噬細胞殺死。
　　10. LED209能夠抑制巨噬細胞內(nèi)沙門氏菌液泡的維持，促進胞內(nèi)細菌與溶酶體融合。氯喹抵抗實驗結(jié)果顯示，在感染早期（2-4小時），巨噬細胞內(nèi)三組細菌在胞質(zhì)中的比例沒有顯著

31、性差異。但在感染后6-8小時，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細胞胞質(zhì)中細菌的比例顯著升高，提示阻斷QseC或敲除qseC后抑制胞內(nèi)SCV的維持，使細菌更易從SCV轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中。
　　為了探討阻斷QseC或敲除qseC抑制胞內(nèi)SCV維持的機理，我們檢測了巨噬細胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌SCV維持相關(guān)基因sopB和sifA的表達水平。結(jié)果顯示，阻斷QseC或敲除qseC后，細菌sopB和sifA的表達水平顯著降低。以上結(jié)果提示，

32、阻斷QseC或敲除qseC后，可能通過抑制sopB和sifA的表達水平，進而抑制巨噬細胞內(nèi)細菌SCV的維持，抑制細菌逃逸胞內(nèi)殺菌分子的殺傷。
　　采用溶酶體轉(zhuǎn)運實驗評價溶酶體與細菌的融合能力。結(jié)果顯示，WT菌株感染組細菌吸光度一直維持在較低水平，而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組的吸光度值在感染后顯著升高。以上結(jié)果表明，WT細菌能夠抑制溶酶體的融合，阻斷QseC或敲除qseC能夠促進胞內(nèi)細菌與溶酶體融合，利于巨噬細胞殺傷胞

33、內(nèi)細菌。
　　11.在感染小鼠體內(nèi)證實LED209的抗感染保護作用與抑制巨噬細胞焦亡和增進感染細菌對活性氧活性氮敏感性相關(guān)。給予小鼠caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk預處理后進行感染，記錄感染小鼠生存率和生存時間。結(jié)果顯示，Ac-YVAD-cmk處理后，WT菌株感染組小鼠生存時間顯著延長，腹腔巨噬細胞焦亡率、caspas-1和 IL-1β活化形式的表達水平以及血清IL-1β的釋放量顯著降低。提示Ac-YVAD-cmk處

34、理通過抑制炎性復合體激活，進而抑制過度的炎癥反應和巨噬細胞焦亡，延長小鼠生存時間。
　　給予小鼠活性氧和活性氮抑制劑DPI預處理后進行感染，記錄感染小鼠生存率，計數(shù)臟器CFU。結(jié)果顯示，DPI處理后，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組小鼠生存率顯著降低，且肝臟和脾臟荷菌量顯著升高，表明 DPI處理可以減弱 LED209的體內(nèi)抗感染保護效應，提示活性氧和活性氮參與了體內(nèi)阻斷QseC和敲除qseC鼠傷寒沙門氏菌的清除。
　

35、　結(jié)論：
　　1.發(fā)現(xiàn)LED209的體內(nèi)抗感染保護效應主要由巨噬細胞參與介導。
　　2.發(fā)現(xiàn) LED209通過阻斷鼠傷寒沙門氏菌 QseC，抑制其鞭毛蛋白基因 flhDC的表達，進而抑制巨噬細胞NLRC4炎性復合體的活化和巨噬細胞焦亡的發(fā)生。
　　3.發(fā)現(xiàn) LED209阻斷鼠傷寒沙門氏菌 QseC可以促進巨噬細胞清除胞內(nèi)細菌，該效應與抑制鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi) SCV的維持，促進細菌由 SCV向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，促進細菌與溶酶體融