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文檔簡介
1、目的:
非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)已經(jīng)成為核酸和蛋白質(zhì)之外參與基因表達(dá)調(diào)控的另一類重要因子。本課題組通過對傷寒沙門菌(SalmonellaentericaserovarTyphi,S.Typhi)RNA序列分析和生物信息學(xué)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)了包括AsrC在內(nèi)的一些ncRNAs。本研究旨在對S.TyphincRNAAsrC進(jìn)一步鑒定,并研究其特性,以便對AsrC參與的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行深入研究。
2、 方法:
1.AsrC的鑒定:利用NorthernBlot和qRT-PCR對AsrC進(jìn)行存在性、完整性驗證,并觀察其生長時相表達(dá)特性。
2.AsrC的分子全長鑒定:分別利用5′和3′RACE實驗尋找AsrC的轉(zhuǎn)錄起始點和轉(zhuǎn)錄終止點,以確定AsrC的分子全長。
3.AsrC在應(yīng)激條件下的表達(dá)量分析:利用NorthernBlot和qRT-PCR對傷寒沙門菌在不同生長時期,酸、氧及高滲環(huán)境應(yīng)激后As
3、rC的水平進(jìn)行分析。
4.基因缺陷變異株的制備:利用λ-Red系統(tǒng)制備傷寒沙門菌asrC基因啟動子缺陷變異株。
5.基因缺陷回補(bǔ)株的制備:利用重組質(zhì)粒pBAD/gⅢ將lepA基因和pBAD/gⅢ空質(zhì)粒分別導(dǎo)入asrC基因啟動子缺陷變異株,構(gòu)建lepA基因的缺陷回補(bǔ)株和lepA缺陷空質(zhì)粒對照株。
6.asrC基因啟動子缺失的定量分析:qRT-PCR分析S.Typhi野生株、asrC基因啟動子缺陷株
4、中AsrC的水平。
7.生長曲線的測定:制作生長曲線,觀察S.Typhi野生株、asrC基因啟動子缺陷株、lepA基因缺陷回補(bǔ)株及空質(zhì)粒對照株在等滲、氧應(yīng)激、酸應(yīng)激和高滲應(yīng)激時的生長狀況。
結(jié)果:
1.經(jīng)NorthernBlot和qRT-PCR分析,確定AsrC存在表達(dá),并發(fā)現(xiàn)其在對數(shù)生長后期(OD6000.8)時AsrC的表達(dá)量最高。
2.經(jīng)過5'和3'RACE實驗鑒定AsrC的
5、分子全長信息,并確定其分子全長為893bp,與lepA基因部分重疊。
3.NorthernBlot和qRT-PCR結(jié)果表明,S.TyphiAsrC在酸、氧及高滲應(yīng)激時的表達(dá)量均下降。
4.利用λ-Red系統(tǒng)成功制備S.Typhi包含asrC基因啟動子區(qū)域500bp的缺陷變異株。
5.PCR及序列分析結(jié)果表明,成功構(gòu)建pBAD-lepA陽性重組質(zhì)粒,并成功將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ分別導(dǎo)入a
6、srC基因啟動子基因缺失變異株中,成功制備lepA基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒對照株。
6.qRT-PCR結(jié)果顯示,與S.Typhi野生株相比,asrC基因啟動子缺失變異株中AsrC的水平顯著降低。
7.生長曲線分析結(jié)果顯示,在氧應(yīng)激時asrC基因啟動子缺失變異株生長明顯比S.Typhi野生株慢(P<0.05),而lepA基因回補(bǔ)株及空質(zhì)粒株的生長速度與野生株相似;在等滲條件、酸應(yīng)激和高滲應(yīng)激時,四種菌株的生長狀況
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