傷寒沙門菌鞭毛基因表達相變換機制研究.pdf

1、食品是人類生存和發(fā)展的基本需求之一，它提供人體生長發(fā)育、維持生命以及進行各種活動所需的能量和營養(yǎng)物質。食品與人們的生活息息相關，因而食品的安全性對人類健康就顯得至關重要。食品中微生物污染是食品安全最主要的問題之一，如沙門菌對食品的污染而引起的食物中毒，即使在西方發(fā)達國家也有明顯上升的趨勢。沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的一個重要菌屬，為革蘭氏陰性，需氧或兼性厭氧，絕大部分有鞭毛，具有運動

2、性的桿狀細菌，是人類研究最為廣泛和深入的食源性病原微生物。沙門菌主要棲息在動物的腸道，隨糞便排出后就可污染其他周圍環(huán)境，污染的食品被人或動物食用后，再經(jīng)過腸道、糞便繼續(xù)循環(huán)，可通過食品或飼料的國際貿易而擴大，這是沙門菌在世界范圍廣泛分布的主要原因。
　　 鞭毛(flagella)是細菌的動力裝置，也是沙門菌的一種重要的毒性因子。鞭毛基因的表達調節(jié)在沙門菌的感染過程中，尤其是在侵襲過程中具有極其重要的作用，因此鞭毛缺損變異使沙門菌

3、的致病力大為降低。沙門菌的鞭毛具有極為豐富的多態(tài)性，通過血清學檢查，已有近100種不同鞭毛抗原被發(fā)現(xiàn)，命名為a至z和zl至zN。沙門菌鞭毛抗原的多態(tài)性與基因的水平轉移和局部變異相關。據(jù)菌體和鞭毛抗原特性，已有2200多種沙門菌血清型被發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)的血清型，如鼠傷寒沙門菌(S.Typhimurium)有兩相不同的鞭毛素編碼基因，分別位于染色體不同的部位，稱之為Ⅱ相菌株。常以fliC和fljB分別表示Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素編碼基因。在沙門菌入侵宿

4、主的過程中，會激活宿主的免疫系統(tǒng)使機體產(chǎn)生抗體來應付細菌的入侵，大部分沙門菌則可以通過改變抗原的表達來應對這種抗體應激。這種在鞭毛抗體存在的條件下，兩相沙門菌等可自行變換鞭毛抗原表達的特性稱之為相變換(phase variation)，這可能是細菌逃避宿主免疫監(jiān)控的機制之一。
　　 傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是沙門菌屬中一種重要的人類腸道致病菌，其通過污染食物

5、進入消化道，克服胃酸、高滲腸液及腸道正常菌群的防御作用，在空腸遠端侵入腸上皮M細胞，并能進一步在局部腸系膜淋巴組織和吞噬細胞中存活和增殖，再經(jīng)淋巴液和血液系統(tǒng)進入肝脾等組織，造成全身系統(tǒng)性感染-“傷寒”(typhoid fever)。傷寒沙門菌從環(huán)境至人體空腸的遠端，需經(jīng)一系列調節(jié)，如增加莢膜(Vi)抗原表達以克服劇烈胃酸環(huán)境影響，進入腸道后減少莢膜抗原的表達，增加鞭毛抗原與一些編碼基因位于沙門菌致病島Ⅰ(Salmonella Path

6、ogenic Island1，SPI-1)的侵襲因子的表達，以協(xié)助細菌粘附于腸上皮M細胞，進而侵入腸上皮組織。因此，在感染過程中傷寒沙門菌應對各種不同環(huán)境應激的自身調節(jié)極為重要。
　　 目的：
　　 長期以來人們都認為傷寒沙門菌為單相菌株，即只有Ⅰ相鞭毛素編碼基因fliC，其相應的抗原為d抗原或j抗原(d抗原編碼基因的中央可變區(qū)缺損了261bp)。1981年Guinee首次在從印度尼西亞分離獲得的傷寒沙門菌菌株中發(fā)現(xiàn)一種

7、新的鞭毛抗原，命名為z66抗原。2004年我們首次成功地克隆了z66抗原的編碼基因fljB：z66，fljB：z66下游525-bp的ORF與鼠傷寒沙門菌等Ⅱ相沙門菌的fljA有較高的相似性，為fljA樣基因，最近我們也證實了該基因是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因。在抗H：z66的鞭毛抗體存在條件下體外培養(yǎng)，z66抗原陽性傷寒沙門菌能改變鞭毛抗原的表達，但這種變化與鼠傷寒沙門菌等的相變換不同，為單向不可逆變化，即只能從z66抗原表達轉

8、變?yōu)閐或i抗原的表達。最近有研究表明，z66抗原的編碼基因位于一罕見的線性質粒中，而且這種單向相變換是與線性質粒缺失變異有關，但相關機制尚不明確。另外，我們也首次發(fā)現(xiàn)有兩株不同來源(日本和印度)的z66+傷寒沙門菌野生株有不同的鞭毛相變換表象，即在抗體誘導后其線性質粒可發(fā)生部分和完全缺失的兩種不同現(xiàn)象。已有研究表明，鞭毛可作為鼠傷寒沙門菌的外部特殊感受器，感受環(huán)境濕度和溫度，發(fā)揮對自身鞭毛基因的表達調節(jié)作用。據(jù)此我們推測，鞭毛與相應的抗

9、體結合后，可以啟動胞內一系列基因表達調節(jié)，最終通過某些關鍵基因的表達改變，致線性質粒的缺失變異而實現(xiàn)單向性鞭毛表達的相變換。本文的目的是為了揭示鞭毛作為細菌外部特殊感受器介導胞內基因的表達調控特性，并通過比較抗體誘導的菌株之間的基因組差異，深入探究z66+傷寒沙門菌鞭毛單向相變換確切的分子機制，為原核生物鞭毛可發(fā)揮特殊感受器的功能提供全新認識。
　　 方法：
　　 (1)傷寒沙門菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表達及其

10、多克隆抗體的制備根據(jù)fljB：z66基因兩端序列設計引物，利用PCR技術從H：z66陽性傷寒沙門菌基因組DNA中得到鞭毛素基因fljB：z66，將該基因克隆到表達載體pET-28a(+)上并在大腸桿菌JM109中進行表達；fljB：z66的表達產(chǎn)物FljB-his6經(jīng)Ni柱純化后作為抗原免疫兔以制備其多克隆抗體。
　　 (2)抗體誘導傷寒沙門菌鞭毛相變換及基因組結構分析利用含抗H：z66抗體的半固體LB平板誘導本實驗室保存的兩株

11、不同來源的H：z66陽性的傷寒沙門菌，然后通過脈沖場凝膠電泳和Southern Blot等技術分析相變換前后細菌染色體結構的變化。同時，通過提取H：z66陽性的傷寒沙門菌GIFU10007及其相變株j菌的線性質粒，通過對其進行DNA測序和酶切鑒定，分析相變換前后細菌線性質粒的結構變化。
　　 (3)抗體脅迫下傷寒沙門菌鞭毛介導的基因表達調控分析傷寒沙門菌GIFU10007在兔抗H：z66多克隆抗體誘導30分鐘后，利用傷寒沙門菌全

12、基因組芯片分析技術分析其與正常對照血清誘導30分鐘后的傷寒沙門菌GIFU10007的基因表達譜的差異。用同樣的方法分析傷寒沙門菌GIFU10007的缺陷株△fljB：z66在兔抗H：z66多克隆抗體誘導30分鐘后的基因表達譜的變化作為無鞭毛的對照組實驗。選擇部分表達差異顯著的有代表性的基因，設計并合成特異性引物，進行實時熒光定量PCR，驗證基因芯片的分析結果。
　　 (4)兩株具有不同相變換表象野生傷寒沙門菌(GIFU10007

13、和Ind-8)的全基因組結構比較分析提取兩株鞭毛相變換表象不同H：z66陽性傷寒沙門菌野生株的線性質粒，通過PCR技術分析比較這兩株菌各自的線性質粒的DNA序列差異；提取兩株H：z66陽性傷寒沙門菌的基因組DNA，通過Solexa法測定這兩株傷寒沙門菌的全基因組DNA序列，分析比較它們的差異基因，以分析傷寒沙門菌鞭毛相變換的關健因子。
　　 結果：
　　 (1)經(jīng)PCR和酶切鑒定以及DNA測序證實，傷寒沙門菌鞭毛素基因f

14、ljB：z66被成功導入表達載體pET-28a(+)，并在大腸桿菌JM109中獲得了高效表達，以此表達的蛋白作為抗原成功制備了兔抗z66的多克隆抗體。
　　 (2)本實驗室保存的兩株不同來源的H：z66陽性的傷寒沙門菌的基因fljB：z66均位于一罕見的線性質粒中，在兔抗H：z66多克隆抗體的誘導下均成功發(fā)生了鞭毛抗原從表達z66至表達d/j的單向相變換，這種單向相變換是由于傷寒沙門菌在抗體誘導下線性質粒缺失了含fljBA的2.

15、6 kb末端區(qū)域或線性質粒的全部丟失所導致的。
　　 (3)傷寒沙門菌GIFU10007在抗H：z66抗體誘導30min后，187個基因的表達發(fā)生了3倍以上的明顯變化，其中有122個基因表達上調，包括構成核糖體的多種蛋白質基因和參與轉錄和蛋白質合成的多種因子等；同時也有65個基因在抗體誘導后表達下調，其中包括多種代謝酶和轉錄調節(jié)因子基因等。實時熒光定量RT-PCR進一步驗證了基因芯片實驗的部分結果與基因表達譜分析實驗結果基本一致

16、，表明在鞭毛抗體應激下，傷寒沙門菌的鞭毛確實可以作為外部的感受器，介導大量的基因表達調節(jié)。
　　 (4)兩株在抗H：z66多克隆抗體的誘導下具有不同相變換表象的傷寒沙門菌其fljB：z66所在的線性質粒DNA序列沒有明顯的差異。這兩株細菌的全基因組測序分析表明，共有628個基因具有顯著的差異，其中185個基因在傷寒沙門菌GIFU10007中沒有，只存在于H：z66陽性傷寒沙門菌Ind-8野生株中，其余有差異的基因其DNA序列差異

17、都在40％以上。在這185個基因中，包括了多種參與DNA復制、修復、轉錄、調控和信號轉導的基因，以及編碼多種代謝酶和功能未知的蛋白基因。
　　 結論：
　　 (1)本文成功克隆了傷寒沙門菌鞭毛素基因fljB：z66，表達了其編碼蛋白Z66，并制備了兔抗Z66的多克隆抗體。
　　 (2)利用制備的兔抗H：z66的多克隆抗體，成功誘導了兩株不同來源的z66+傷寒沙門菌的鞭毛單向性相變換，同時還表明了兩株細菌的fljB

18、：z66基因位于一罕見的線性質粒上，在抗H：z66的抗體的誘導下，線性質粒會完全丟失和僅丟失含fljBA的2.6 kb末端區(qū)域不同的變化；
　　 (3)揭示了H：z66陽性傷寒沙門菌的鞭毛可以作為一特殊感受器來介導胞內基因的表達調控；
　　 (4)發(fā)現(xiàn)了兩株鞭毛相變換表象不同的H：z66陽性傷寒沙門菌野生株，它們具有628個差異顯著的基因，其中某些基因可能是鞭毛相變換作用的關健因子，為進一步深入研究傷寒沙門菌線性質粒介導