傷寒沙門菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因的篩選鑒定.pdf

1、傷寒沙門菌是一種感染人的病原菌,能夠引起腹瀉、傷寒、淋巴結(jié)病、肝脾大、腦病、腸出血和腸穿孔等一系列疾病,2000年,全球估計(jì)發(fā)生傷寒病例2100萬例,其中約21萬人死亡。近年來,由于多重耐藥菌株的出現(xiàn),使得治療變得更加困難,迫切需要新的診斷、預(yù)防和治療方法。這些都需要對其致病機(jī)制的認(rèn)識,但人是傷寒的唯一宿主,目前還沒有適合傷寒研究的動(dòng)物模型,這給傷寒沙門菌致病機(jī)制的認(rèn)識帶來很大困難,因而目前關(guān)于傷寒致病機(jī)理方面仍然有很多不清楚的環(huán)節(jié)。致

2、病菌的致病過程是與宿主細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過程,需要許多致病基因的協(xié)調(diào)作用。致病菌在宿主體內(nèi)的環(huán)境與體外明顯不同,為了適應(yīng)這種環(huán)境的變化,細(xì)菌會(huì)通過調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)作出適應(yīng)性反應(yīng):下調(diào)非必須基因的表達(dá),上調(diào)在宿主體內(nèi)存活中起關(guān)鍵作用的基因(例如獲得營養(yǎng)的基因和逃避宿主免疫的基因)以及表達(dá)那些感染宿主所必須的毒力基因。致病菌在宿主體內(nèi)表達(dá)而在體外不表達(dá)的這些功能基因稱為“體內(nèi)誘導(dǎo)基因”(in vivo-induced gene,ivi g

3、ene)。大量的研究表明,這些獨(dú)特的在體內(nèi)表達(dá)而在體外不表達(dá)的基因往往對病原菌在體內(nèi)的生存和致病有重要意義。本文利用“體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)抗原技術(shù)”(in vivo-induced antigen technology,IVIAT)篩選傷寒沙門菌的ivi基因。其研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.傷寒病人血清的收集與處理:收集初次就診并從未進(jìn)行過抗傷寒藥物治療的傷寒病患者血清,挑選肥達(dá)反應(yīng)效價(jià)較高的3個(gè)傷寒病人的血清,等體積

4、混合。首先用傷寒沙門菌Ty2、大腸桿菌BL21(DE3)全菌體吸附,然后再依次用細(xì)菌超聲裂解物和熱變性超聲裂解物吸附。每步吸附反應(yīng)結(jié)束后,都取出10μl血清,以傷寒沙門菌超聲裂解物為抗原,ELISA檢查吸附效果。結(jié)果顯示隨著吸附步驟的進(jìn)行,OD值越來越低,說明相應(yīng)吸附血清中含有的針對傷寒沙門菌體外表達(dá)抗原的抗體越來越少,最后OD值穩(wěn)定在一定的水平,說明經(jīng)過吸附處理,血清中已經(jīng)幾乎不含有針對傷寒沙門菌體外抗原的抗體。
　　 2.表

5、達(dá)文庫的構(gòu)建:表達(dá)文庫用pET-30abc表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建。該系統(tǒng)由3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成,一段基因組DNA插入到這三個(gè)表達(dá)載體后,能保證在可能出現(xiàn)的三種讀框中,至少有一種是符合實(shí)際序列讀框的,從而在誘導(dǎo)表達(dá)后獲得一個(gè)序列正確的蛋白質(zhì)或肽段。病原菌基因組DNA用Sau3AI進(jìn)行不完全酶切,酶切產(chǎn)物凝膠電泳,取長度位于0.5～1.5 Kb區(qū)域的DNA片段純化,與預(yù)先用BamHI線性化的pET30abc載體DNA進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH

6、5α,接種含卡那霉素平板,收集轉(zhuǎn)化子并回收質(zhì)粒,再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。最終獲得的基因組文庫總量達(dá)到6.0×104,90％以上的都是含有插入外源片段的重組質(zhì)粒,文庫總量達(dá)到要求所需數(shù)量。
　　 3.表達(dá)文庫的篩選:將上述電轉(zhuǎn)獲得的表達(dá)文庫菌液涂布含卡那霉素的LB平板上,使每個(gè)平板產(chǎn)生約400個(gè)菌落。待菌落長到針尖大小時(shí),將其轉(zhuǎn)印到含卡那霉素和IPTG的LB平板上,經(jīng)37℃誘導(dǎo)5小時(shí)。再將平板放到盛有氯仿的搪瓷盤中,氯仿

7、蒸汽作用15min使菌落部分裂解。將裂解菌落吸附到NC膜上,再用10％脫脂奶粉液封閉過夜。將封閉好的NC膜依次與吸附后血清、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人Ig抗體室溫下各反應(yīng)1h,PBS-T(含0.5％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)洗滌,ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。X光片上明顯區(qū)別于淡色背景下的黑點(diǎn)所對應(yīng)的菌落即為初步確定的陽性克隆。將初步確定的陽性克隆和只含pET-30空載體的大腸桿菌BL21(DE3)陰性對照菌同時(shí)接種含卡那霉素和IPTG的

8、LB平板,重復(fù)以上免疫篩選步驟,進(jìn)一步確證。提取純化陽性克隆質(zhì)粒并測序,PCR克隆全基因,酶切連接到pET30a載體的5'NdeI和3'NotI限制性酶切位點(diǎn),以只含pET-30a空載體的大腸桿菌BL21(DE3)陰性對照菌,重復(fù)以上免疫篩選步驟,進(jìn)行第三次篩選。最后得到7個(gè)ivi基因,他們是bcfD(t0025),grxC(t3817),sapB(t1598),t3663,t3816,t1497和t3689,他們的功能涉及菌毛結(jié)構(gòu)組成

9、,物質(zhì)運(yùn)輸和代謝。
　　 4.RT-PCR驗(yàn)證:LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)傷寒沙門菌Ty2,用TRIzol提取其總RNA,Rnase-Free Dnase I處理消除DNA后,以所篩選的7個(gè)ivi基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,并設(shè)立陽性對照。凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果顯示,t3689,6cfD,sapB,grxC和t3816這5個(gè)基因有電泳條帶,條帶位置基本與基因大小相符,說明它們在體外是有表達(dá)的;t3663和t1497這兩2個(gè)