沙門菌體內(nèi)耐藥誘導(dǎo)模型的建立及體外誘導(dǎo)耐藥菌RNA-seq分析.pdf

1、沙門菌是一類常見的人畜共患病原菌，絕大多數(shù)對人和動(dòng)物致病，可造成人和動(dòng)物的傷寒、副傷寒、敗血癥和食物中毒等疾病，是公共衛(wèi)生的重要威脅。隨著氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）的普遍使用，沙門菌對FQs的耐藥水平不斷升高，耐藥問題日益嚴(yán)重。目前通常使用FQs對敏感菌進(jìn)行體外誘導(dǎo)來研究耐藥機(jī)制，但是體外誘導(dǎo)并不能確切反映沙門菌在體內(nèi)時(shí)的耐藥性產(chǎn)生機(jī)理，因?yàn)閯?dòng)物體內(nèi)是復(fù)雜的生物環(huán)境，機(jī)體的代謝、免疫機(jī)制等都可能會對細(xì)菌的

2、耐藥機(jī)理產(chǎn)生影響。本研究以秀麗隱桿線蟲N2野生型為宿主，將鼠傷寒沙門菌ATCC13311定植于線蟲體內(nèi)，然后使用梯度濃度遞增法提高培養(yǎng)液中的環(huán)丙沙星濃度，誘導(dǎo)在線蟲體內(nèi)的沙門菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)。分別擴(kuò)增體內(nèi)誘導(dǎo)和體外誘導(dǎo)耐藥菌的gyrA、gyrB、parC和parE基因的氟喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance determining regions，QRDR）以及外排泵抑制子基因（acrR、ma

3、rR、ramR和soxR），對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和分析。然后分別構(gòu)建鼠傷寒沙門菌ATCC13311和體外誘導(dǎo)耐藥株的轉(zhuǎn)錄組測序文庫并進(jìn)行Illumina RNA-seq雙向測序，對ATCC13311和體外誘導(dǎo)耐藥菌的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。最后采用熒光定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌ATCC13311可以穩(wěn)定定植于線蟲體內(nèi)，在線蟲消化道內(nèi)集中分布于咽部和腸道，經(jīng)過環(huán)丙沙星誘導(dǎo)后可產(chǎn)生穩(wěn)定

4、耐藥菌株。經(jīng)過誘導(dǎo)后得到環(huán)丙沙星MIC為4μg/mL的耐藥菌TN4，體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)獲到了環(huán)丙沙星MIC為4μg/mL的耐藥菌TW4。TN4的gyrA基因發(fā)生了Asp87Asn突變。體外誘導(dǎo)耐藥菌TW4的gyrA基因發(fā)生了Ser83Phe和Asp87Val突變，ramR基因出現(xiàn)了20bp的缺失。
　　對ATCC13311和體外誘導(dǎo)耐藥菌TW4進(jìn)行RNA-seq測序后獲得了4.46 G有效數(shù)據(jù)，通過de novo拼接，獲得了311條un

5、igene，平均長度為15587 bp。拼接所得到的全序列長度為4847532 bp，經(jīng)預(yù)測4998條基因中有4902條得到GO注釋。采用COG功能將注釋基因劃分為25類，共有3735個(gè)基因得到注釋。將TW4與ATCC13311相比較，有3434個(gè)基因表達(dá)量顯著上升，32個(gè)基因表達(dá)量顯著下降，7條代謝途徑表達(dá)差異顯著。對表達(dá)量改變明顯的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)22個(gè)與耐藥直接相關(guān)或者與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量顯著上升。熒光定量PCR結(jié)果顯示

6、acrB、acrD和soxS的基因表達(dá)量與RNA-seq結(jié)果趨勢一致，證實(shí)RNA-seq可靠。
　　本研究建立了鼠傷寒沙門菌-秀麗隱桿線蟲體內(nèi)耐藥性誘導(dǎo)模型，并比較了體內(nèi)誘導(dǎo)耐藥菌和體外誘導(dǎo)耐藥菌的基因突變差異。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）對鼠傷寒沙門菌ATCC13311和其誘導(dǎo)耐藥株TW4進(jìn)行研究，揭示了鼠傷寒沙門菌耐藥性誘導(dǎo)前后差異表達(dá)的基因和顯著變化的代謝途徑，為深入研究細(xì)菌耐藥機(jī)制及與細(xì)菌代謝途徑之間的聯(lián)系提供重要