志賀菌誘導(dǎo)耐藥相關(guān)基因序列克隆與測序.pdf

1、志賀菌是細(xì)菌性痢疾的病原體，全世界每年大約有1.65億人感染志賀菌，以發(fā)展中國家居多，患者多為五歲以下兒童。在我國，志賀菌引起的細(xì)菌性痢疾發(fā)病率仍居感染性腹瀉的前三位，是傳染病防治工作的重點(diǎn)。近年來，志賀菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)峻，不僅耐藥廣泛，且耐多藥株逐漸增多，這為細(xì)菌性痢疾的防治帶來很大挑戰(zhàn)。
　　 志賀菌耐藥性的來源主要有兩種方式：通過基因轉(zhuǎn)移的水平方式和通過藥物自身誘導(dǎo)的垂直方式?；蛩睫D(zhuǎn)移是指由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和基因

2、島等可移動(dòng)遺傳因子介導(dǎo)的在細(xì)菌種內(nèi)和種間獲得和傳播耐藥性的方式。藥物自身誘導(dǎo)獲得耐藥性是指細(xì)菌在抗生素壓力下，通過某些遺傳學(xué)機(jī)制的變化獲得耐藥性。為了解在抗生素誘導(dǎo)下，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與基因組自身改變的關(guān)系，本課題組曾通過抗生素誘導(dǎo)的方式獲得了志賀菌敏感株的耐多藥菌株，并成功構(gòu)建了敏感株和耐多藥株基因組的抑制性消減雜交文庫，初步篩選到與耐多藥株相關(guān)的差異基因片段。
　　 目的
　　 在以前研究的基礎(chǔ)上，對耐藥相關(guān)基因序列

3、進(jìn)行分析，推測耐藥性是如何發(fā)生的和發(fā)生的可能部位，為探索志賀菌誘導(dǎo)耐多藥的分子機(jī)制提供線索，為耐藥性檢測提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)手段。
　　 方法：
　　 1菌株的復(fù)蘇與鑒定：對-80℃保存菌株以劃線法復(fù)蘇并接種生化鑒定管進(jìn)行血清學(xué)鑒定，以保證菌株的可靠性。
　　 2提取DNA：分別提取YD(誘導(dǎo)耐多藥株)和Z23(敏感株)的遺傳物質(zhì)DNA和含有差異基因片段質(zhì)粒pMD18-T-X(Y16A11、Y16B3、Y19C3、

4、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8)的DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。
　　 3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
　　 (1)以上述質(zhì)粒DNA為擴(kuò)增模板擴(kuò)增差異基因片段；
　　 (2)以Z23和YD基因組DNA為擴(kuò)增模板擴(kuò)增差異基因片段；
　　 (3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物長度；
　　 4相關(guān)基因的克隆和鑒定：瓊脂糖凝膠電泳分離回收PCR產(chǎn)物，將回收的相關(guān)基因片段與pM

5、D19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，氨芐青霉素抗性和藍(lán)白斑篩選法篩選陽性重組子。并且應(yīng)用菌落PCR和質(zhì)粒單、雙酶切來鑒定陽性重組子。
　　 5基因序列測定與同源性檢索：將陽性克隆交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成測序；在序列相似性搜索工具Blast上檢索核苷酸序列，并分析其同源性。
　　 6斑點(diǎn)雜交：隨機(jī)引物法標(biāo)記將回收純化后差異基因片段Y16A11-Y、Y16A11-Z、Y1683、Y19C3-Y、Y

6、19C3-Z、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8制成探針。分別以相應(yīng)的陽性克隆的質(zhì)粒DNA為陽性對照，與YD和Z23的質(zhì)粒和基因組DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。
　　 結(jié)果：
　　 1質(zhì)粒DNA PCR擴(kuò)增：以pMD18-T-X(Y16A11、Y16B3、Y19C3、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8)質(zhì)粒DNA為模板，選擇差異基因片段引物，分別擴(kuò)增出449bp(Y16A11)、481bp(Y16B3)、3

7、17bp(Y19C3)、1075bp(Y19C1)、298bp(Y19C4)、413bp(Y16C4)、298bp(Y16B8)長度的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。
　　 2 PCR擴(kuò)增結(jié)果：YD菌株(誘導(dǎo)株)分別擴(kuò)增到長度為310bp(Y16A11-Y)、320bp(Y16B3)、124bp(Y19C3-Y)、422bp(Y19C1)、193bp(Y19C4)、227bp(Y16C4)、225 bp(Y16B8)基因DNA片段，敏感株

8、僅擴(kuò)增到2種產(chǎn)物，即554 bp(Y16A11-Z)和388bp(Y19C3-Z)基因片段。
　　 3擴(kuò)增片段的克?。簩⑸鲜霁@得的YD和Z23擴(kuò)增片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，獲得Y16A11-Y、Y16A11-Z、Y16B3、Y19C3-Y、Y19C3-Z、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8等相應(yīng)的陽性克隆菌株。對陽性克隆菌株進(jìn)行PCR鑒定，分別擴(kuò)增到310bp、554bp、320bp、

9、124bp、388bp、422bp、193bp、227bp、225bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致。質(zhì)粒的單酶切和雙酶切結(jié)果也均與預(yù)期一致。
　　 4核苷酸序列測定和同源性檢索：
　　 Y16A11-Y(310bp)：為質(zhì)粒pBS512_5的編碼基因序列的一部分；
　　 Y16A11-Z(554bp)：與脂肪酸代謝調(diào)節(jié)因子編碼序列的同源性為96％～97％；
　　 Y16A11-Y和Y16A11-Z基因片段的

10、核苷酸序列同源性極低；
　　 Y16B3(320bp)：前113 bp基因序列與保守的假定蛋白同源性為99％，后218bp基因序列與IS200C相關(guān)轉(zhuǎn)座酶基因序列同源性為99％；
　　 Y19C3-Y(124bp)：沒有搜索到相似的同源序列，可能為未知序列；
　　 Y19C3-Z(388bp)：該基因序列編碼假定的多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；
　　 Y19C3-Y與Y19C3-Z的序列同源性低；
　　 Y1

11、9C1(422bp)：該核苷酸序列與多藥排出系統(tǒng)組成部分有關(guān)；
　　 Y19C4(193bp)：122～193這一段序列是質(zhì)粒pBS512_5的編碼基因序列上的一部分。
　　 Y16C4(227bp)：為位點(diǎn)特異性Ⅰ型脫氧核糖核酸酶的編碼基因；
　　 Y16B8(225bp)：前67bp為質(zhì)粒pBS512_5的編碼基因序列；
　　 5斑點(diǎn)雜交結(jié)果：探針Y16B8，Y16A11-Y，Y19C3-Y，Y16C

12、4，Y19C4與YD質(zhì)粒和基因組DNA雜交信號均增強(qiáng)，而且基因組雜交信號和質(zhì)粒雜交信號增強(qiáng)程度差別不大；探針Y16B3只與YD基因組雜交信號增強(qiáng)；探針Y16A11-Z，Y19C3-Z與YD基因組、質(zhì)粒DNA和Z23基因組DNA均有較強(qiáng)的雜交信號，而與Z23質(zhì)粒DNA雜交信號較弱；探針Y19C1的雜交信號均比較弱。
　　 結(jié)論：
　　 1志賀菌在抗生素誘導(dǎo)下產(chǎn)生的耐多藥株與敏感菌株比較，具有基因組差異。
　　 2志