紅霉素體外誘導肺炎鏈球菌耐藥的研究.pdf

1、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）是引起中耳炎、鼻竇炎、支氣管炎以及社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，是引起人類死亡的重要原因之一?？股乇粡V泛運用于治療此類感染，然而隨著抗生素的運用，耐藥性日趨嚴重，如此對耐藥機制的研究顯得尤為重要。但目前對耐藥機制的研究主要是通過臨床分離耐藥株與標準敏感菌株之間的對比來進行探討，對于S.pneumoniae能否通過體外誘導耐藥，通過誘導耐藥株與原始菌株

2、之間的對比探討耐藥機制的研究尚未發(fā)現(xiàn)。 本課題通過瓊脂稀釋法測定MIC值獲得對紅霉素敏感的Spneumoniae標準菌株和臨床分離株；將S.pneumoniae接種于含紅霉素的血瓊脂平板上進行耐藥性誘導，紅霉素濃度由0.5MIC逐倍遞增，直至敏感株變?yōu)槟退幹辏瑴y定耐藥株MIC值；將獲得的耐藥子代在無紅霉素血瓊脂平板上連續(xù)傳代20次后，測定其MIC值，以檢測其獲得耐藥的穩(wěn)定性；對比分析誘導耐藥前后Spneumoniae生理生化學性

3、質的變化；小鼠毒力試驗檢測誘導耐藥前后試驗菌株毒力的改變。PCR與RT-PCR對誘導耐藥前后受試菌株rplD、rplV基因以及23SrRNA擴增并測序；CPHmodels-2.0蛋白質空間構象預測系統(tǒng)對誘導耐藥前后受試菌株rplD、rplV基因編碼的核糖體蛋白L4和L22進行空間構象預測分析，并運用PyMOL蛋白質分析軟件對其表面空間構象進行分析。 通過試驗篩選獲得的試驗菌株MIC值均為0.0312mg/L；誘導后標準菌株tig

4、r4MIC值增加到256mg/L，臨床分離株C1和C2MIC值均增加到32mg/L，標準菌株R6MIC值未發(fā)生變化；耐藥子代在連續(xù)傳代20次后，其MIC值未發(fā)生改變；經(jīng)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)誘導耐藥前后S.pneumoniae菌落特征、鏡下形態(tài)以及對Optochin敏感性未發(fā)生改變；小鼠毒力試驗結果顯示誘導耐藥前后S.pneumoniae毒力未發(fā)現(xiàn)明顯改變（P>0.05）；誘導耐藥前后測序結果對比顯示標準菌株tigr4核糖體蛋白L4發(fā)生V32A變異，

5、L22發(fā)生D35G變異；而臨床分離敏感株核糖體蛋白L4發(fā)生Q67R、K68E變異；空間構象分析核糖體蛋白L22的D35G及核糖體蛋白L4的Q67R、K68E變異導致其相應的表面空間構象發(fā)生明顯改變。 綜上所述，Spneumoniae可通過紅霉素體外誘導而導致耐藥，并且該獲得性耐藥穩(wěn)定性較好；誘導耐藥前后S.pneumoniae生理生化學性質及毒力未發(fā)生明顯改變；紅霉素結合域發(fā)生新的變異是S.pneumoniae耐大環(huán)內酯類抗生素