乳酸鏈球菌素耐藥菌株的篩選和耐藥機(jī)理研究.pdf

1、乳酸鏈球菌素Nisin是由部分Lactococcus lactis(乳酸鏈球菌)菌株產(chǎn)生的一種細(xì)菌素，可抑制多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，對(duì)人體安全無(wú)毒，在食品行業(yè)已經(jīng)應(yīng)用了50多年，目前尚未見(jiàn)應(yīng)用中的耐藥菌株報(bào)道。隨著Nisin應(yīng)用的快速增加和普及，Nisin也許也會(huì)象抗生素一樣在自然界中產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥性菌株，從而影響和限制Nisin的使用。本研究從浙江杭州自然界及應(yīng)用Nisin為防腐劑的食品樣品中嘗試分離Nisin的耐藥性菌株，分析在自然界或

2、實(shí)際應(yīng)用環(huán)境中Nisin耐藥菌株產(chǎn)生的原因，并對(duì)耐藥菌株的耐藥機(jī)理進(jìn)行探討。 主要研究結(jié)果如下： 1.乳酸鏈球菌素耐藥菌株的分離篩選和鑒定。 從杭州十個(gè)不同市場(chǎng)采集的土壤、植物葉片及食品樣品中，分離共獲得102個(gè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌菌株，以不同濃度的Nisin篩選，50 IU Nisin抑制其中47個(gè)菌株，占所有菌株的49.0％；100IUNisin抑制61個(gè)菌株(59.8％)；200 IU Nisin抑制84個(gè)菌株(

3、82.4％)；500IUNisin抑制97個(gè)菌株(95.1％)；剩下5個(gè)菌株(NIS06、NIS13、NIS17、NIS41、NIS98)為Nisin高度耐藥菌株，500 IU Nisin不能抑制其生長(zhǎng)。最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定發(fā)現(xiàn)NIS41菌株對(duì)Nisin的MIC達(dá)2560IU，NIS13、NIS17、NIS983個(gè)菌株的MIC為1280IU，NIS06菌株的MIC為640IU。通過(guò)生理生化方法及16SrDNA序列分析5個(gè)細(xì)菌均鑒定

4、為葡萄球菌屬，其中NIS41為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，NIS06，NIS13，NIS98為松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)，NIS17為木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。 2.5個(gè)Nisin耐藥菌株的耐藥性分析。 分離自自然界及市場(chǎng)樣品的5個(gè)Nisin耐藥菌株S.epidermidisNIS41、S.sciuriNIS06、

5、S.sciuriNIS13、SsciuriNIS98、S.xylosusNIS17在無(wú)Nisin的培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接30個(gè)世代后，對(duì)Nisin的耐藥性沒(méi)有發(fā)生顯著改變，說(shuō)明這5個(gè)Nisin耐藥菌株的耐藥性具有較好的遺傳穩(wěn)定性。用堿裂解法提取，5個(gè)菌株均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒；以這5個(gè)菌株的基因組DNA為模板，以NisI/NisFEG部分序列為引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)未能擴(kuò)增到NisI/NisFEG疑似基因，說(shuō)明上述菌株不存在類似乳酸鏈球菌的

6、相關(guān)免疫基因。以LB液體培養(yǎng)基、黃色微球菌的去菌液為對(duì)照，5個(gè)耐藥菌株的培養(yǎng)去菌液37℃分別處理Nisin8h，與對(duì)照相比，Nisin活性明顯降低，表明這5個(gè)耐藥菌株的去菌液中存在著Nisin失活物質(zhì)，這可能是其主要的耐藥機(jī)制。 3.耐藥菌株S.epidermidis NIS 41 Nisin失活物質(zhì)(NIS)研究。 Nisin失活物質(zhì)(NIS)在Nisin耐藥菌株Staphylococcus epidermidis N

7、IS 41的生長(zhǎng)穩(wěn)定期開(kāi)始大量產(chǎn)生。培養(yǎng)液中的NIS在80％飽和度硫酸銨濃度下無(wú)法沉淀。37℃、60℃處理20分鐘對(duì)NIS活力無(wú)明顯影響，80℃以上處理活力下降。NIS在pH4～10內(nèi)具有活性，最適pH值在8.0左右。NIS4℃下保存8天以內(nèi)活力基本穩(wěn)定，8天以后活力開(kāi)始下降，15天左右活力完全喪失。二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、無(wú)水乙醚無(wú)法從水中萃取NIS，乙醇、丙酮、甲醇無(wú)法沉淀NIS。30℃真空條件下NIS可揮發(fā)。NIS對(duì)

8、Nisin具有抑制作用，但對(duì)地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis ZJU12產(chǎn)生的細(xì)菌素?zé)o抑制。Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NIS對(duì)Nisin具有降解作用，但用NIS處理BSA沒(méi)有觀察到降解現(xiàn)象。NIS的初提液經(jīng)過(guò)凍融分管濃縮，高效液相色譜HPLC分離后，電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)分析得到NIS的分子量174.9。 4.Nisin的商業(yè)產(chǎn)品的純化及對(duì)其抑菌作用的影響。 Nisin的商業(yè)產(chǎn)品

9、經(jīng)過(guò)CM-32離子交換色譜，1Kda的透析袋透析脫鹽濃縮，并以Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)純度，獲得Nisin純品。檢測(cè)Nisin粗品和Nisin純品對(duì)黃色微球菌M.flavusNCIB8166，表皮葡萄球菌S.epidermidis NIS 41，大腸桿菌Escherichia coli BL21，乳酸鏈球菌Lactococcus lactis LY3的最小抑菌濃度，Nisin粗品和純品對(duì)M.flavus NCIB 8166的

10、MIC為50IU；對(duì)Nisin耐藥菌株S.epidermidis NIS 41的MIC都是3200IU；25600IU的Nisin純品與Nisin粗品都無(wú)法抑制E.coli BL21和L.lactis LY3，說(shuō)明Nisin純品與Nisin粗品對(duì)這四個(gè)菌株的抑菌活性沒(méi)有顯著差異，純化作用對(duì)Nisin的抑菌并沒(méi)有影響。平板計(jì)數(shù)瓊脂法檢測(cè)NaCl對(duì)Nisin抑菌作用的影響，發(fā)現(xiàn)OmM，50mM，100mMNaCl濃度條件下，Nisin粗品與