副雞禽桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選研究.pdf

1、副雞禽桿菌（Avibacteriumparagallinarum，Apg）是雞傳染性鼻炎的致病菌，主要引起雞的生長(zhǎng)發(fā)育受阻，產(chǎn)蛋量下降，給養(yǎng)雞業(yè)帶了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。病原菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的研究是探索該病防治措施的重要基礎(chǔ)。
　　 副雞禽桿菌侵入宿主后，為了適應(yīng)體內(nèi)的環(huán)境，會(huì)啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)，這些體內(nèi)誘導(dǎo)基因有可能是引起疾病的關(guān)鍵基因，有可能作為候選的免疫及藥物分子新靶位。
　　 本研究首先提取Apg的基因組DNA，用S

2、au3AI酶切后回收片段插入到pET系統(tǒng)表達(dá)載體中，構(gòu)建副雞禽桿菌的全基因組表達(dá)文庫(kù)。應(yīng)用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(Invivoinducedantigentechnology，IVIAT)的原理，先用IPTG誘導(dǎo)文庫(kù)表達(dá)蛋白，然后用經(jīng)體外培養(yǎng)的副雞禽桿菌菌株和大腸桿菌BL21(DE3)吸附過(guò)的雞副雞禽桿菌血清對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行初篩和復(fù)篩，對(duì)篩選得到的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒用T7啟動(dòng)子引物測(cè)序，測(cè)得的序列在NCBI上比對(duì)后確定開(kāi)放閱讀框(ORF)。以篩選獲

3、得的H18莢膜合成域2基因簇為研究對(duì)象構(gòu)建基因缺失載體，然后將H18基因缺失載體電轉(zhuǎn)入副雞禽桿菌，用卡那霉素和蔗糖進(jìn)行篩選，用PCR初步鑒定H18基因缺失的菌株。
　　 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了副雞禽桿菌基因組表達(dá)文庫(kù)，文庫(kù)大小為6×103，文庫(kù)重組質(zhì)粒含有率大于80％，達(dá)到了理論要求。經(jīng)過(guò)篩選、測(cè)序和比對(duì)本實(shí)驗(yàn)最終確定了5個(gè)開(kāi)放閱讀框。有一個(gè)表達(dá)為轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰還原酶，一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止因子和莢膜合成域2基因簇，還有兩個(gè)表達(dá)為保守假想蛋白。在此基礎(chǔ)