胸膜肺炎放線桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的篩選與分析鑒定.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP)的病原菌。主要引起豬傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)APP莢膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同可將APP分為15個(gè)血清型，每個(gè)血清型的流行地區(qū)和毒力有所差別，我國主要流行1、2、3和7型。APP的主要毒力因子包括莢膜多糖

2、(CPS)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(Tbp)、RTX外毒素、粘附因子、尿酶、蛋白酶等。根據(jù)這些毒力因子的功能，研究人員開發(fā)了許多候選疫苗用來預(yù)防和控制該病。但用于臨床的主要是滅活苗和亞單位疫苗，其免疫保護(hù)力有限，不能提供對(duì)不同血清型的交叉保護(hù)作用，所以迫切需要開發(fā)新型疫苗來預(yù)防和控制該病。病原分子生物學(xué)與致病機(jī)理的研究是新型疫苗設(shè)計(jì)和開發(fā)的基礎(chǔ)，對(duì)APP感染過程相關(guān)基因進(jìn)行研究是非常必要的。本課題構(gòu)建了APP

3、血清JL-03型菌株的基因組表達(dá)文庫，制備了APP感染豬的康復(fù)血清，運(yùn)用免疫學(xué)技術(shù)篩選到14個(gè)APP的體內(nèi)誘導(dǎo)的抗原基因，并對(duì)部分體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因進(jìn)行了免疫原性研究。主要研究成果如下：
　　 APP基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建：提取APPJL-03型的基因組DNA，用Sau3AI酶切后回收0.5～2kb的片段，分別克隆到原核表達(dá)載體pET-28a/b/c中，轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建了基因組表達(dá)文庫。文庫大小分別為2.50×104cfu/μL、1

4、.91×104cfu/μL和2.12×104cfu/μL；文庫重組質(zhì)粒含有率大于60％，可以進(jìn)行篩選研究。
　　 血清抗體探針的制備：用非致死劑量5×105cfu攻毒豬只，收集康復(fù)血清，用硝酸纖維膜塑模分別吸附菌體抗原和分泌抗原，吸附4次后，ELISA檢測血清吸附效果（OD630由1.23下降到0.16），且第3次和第4次基本無變化，即得到抗體探針，可用于文庫篩選。分別地陽性重組質(zhì)粒。
　　 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的篩選：用IPT

5、G誘導(dǎo)表達(dá)文庫蛋白，用免疫印跡方法進(jìn)行文庫篩選，篩選到11個(gè)克隆，對(duì)篩選到的陽性克隆測序，測得的序列用軟件BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，確定開放閱讀框(ORF)，共包括14個(gè)ORF.
　　 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原免疫原性驗(yàn)證：從14個(gè)ORF中選出3個(gè)在各血清型相對(duì)保守的基因，進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了驗(yàn)證。將pkyA、purR3、mutT2三個(gè)基因克隆到表達(dá)載體pET-28a中，進(jìn)行表達(dá)純化，通過Western-blot驗(yàn)證，