豬胸膜肺炎放線桿菌檢測(cè)及其ApxⅣ基因克隆與表達(dá).pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)感染引起豬的一種以急性出血性和慢性纖維素性胸膜肺炎病變?yōu)樘卣鞯暮粑纻魅静?。本病呈世界性分布，在歐洲、北美洲、南美洲、大洋洲及亞洲等地區(qū)養(yǎng)豬國(guó)家均有病例報(bào)道，特別是養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；c集約化發(fā)展，危害程度日趨嚴(yán)重，已成為影響現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染

2、病之一。1987年我國(guó)首次報(bào)道本病，1996年蔡一鳴等通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、大體病理學(xué)檢查和病原學(xué)鑒定等首次證實(shí)本病在我省的存在。本研究開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的工作：
　　1．貴州省豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)調(diào)查：采用間接凝集試驗(yàn)對(duì)2007年841份和2008年1056份豬血清樣本進(jìn)行豬傳染性胸膜肺炎血清抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示：2007年免疫豬群和非免疫豬群抗體陽(yáng)性率分別為63.6％和50.3％，其中種豬場(chǎng)、規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)、養(yǎng)殖小區(qū)、散

3、養(yǎng)戶和屠宰場(chǎng)豬群相應(yīng)為45.4％、60.2％、44.4％、25.0％和46.8％，而在哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和種豬中的血清抗體陽(yáng)性率分別為47.6％、30.3％、62.2％和60.0％。2008年免疫豬群和非免疫豬群抗體陽(yáng)性率分別為78.5％和38.0％，其中種豬場(chǎng)、規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)、養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)戶和屠宰場(chǎng)豬群相應(yīng)為36.2％、52.2％、28.6％、12.5％和41.8％，而在哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和種豬中的血清抗體陽(yáng)性率分別為3

4、7.1％、23.5％、47.4％和42.7％。這些結(jié)果表明，該病的免疫預(yù)防效果良好，在貴州省不同飼養(yǎng)方式豬場(chǎng)以及不同生長(zhǎng)階段豬群已普遍存在豬傳染性胸膜肺炎感染。
　　2．豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR檢測(cè)技術(shù)研究：根據(jù)Genebank收錄的豬胸膜肺炎放線桿菌外膜脂白 A基因保守序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物，對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌參考菌株和其它種屬菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，并比較了不同的模板提取方法，結(jié)果顯示：建立的PCR方法對(duì)9個(gè)血清型豬胸膜肺炎

5、放線桿菌菌株均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的339bp特異性條帶，而對(duì)支氣管敗血波氏桿菌、奇異變形桿菌、都柏林沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等均呈陰性反應(yīng)，且其模板最小檢出量可達(dá)到0.14ng；同時(shí) SDS-蛋白酶 K法、煮沸法和槍尖法提取的DNA模板對(duì)該 PCR方法的擴(kuò)增效果影響不明顯。這些結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功建立了特異、敏感的
　　豬胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測(cè)方法，為豬傳染性胸膜肺炎的快速診

6、斷提供了技術(shù)支持。
　　3．豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR分群研究：根據(jù)Genebank收錄的不同血清型豬胸膜肺炎放線桿菌外膜脂白 A基因序列的差異，設(shè)計(jì)合成了4對(duì)引物(即相同上游引物與不同下游引物)，對(duì)豬傳染性胸膜肺炎疫苗菌株、其它參考菌株和不同血清型豬胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：建立的PCR分群方法對(duì)豬傳染性胸膜肺炎疫苗菌株可擴(kuò)增出983bp、666bp和382bp大小的三條 DNA帶，與該疫苗所含血清型(Ⅰ、Ⅱ和Ⅶ

7、血清型)預(yù)期擴(kuò)增條帶大小相一致；對(duì)上述其它種屬參考菌株均呈陰性反應(yīng)；對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ等9個(gè)血清型豬胸膜肺炎放線桿菌均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶(983bp、666bp、382/415bp和591bp)。這些結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的多重 PCR方法，可以用于豬胸膜肺炎放線桿菌血清群的劃分。
　　4．豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因克隆與序列測(cè)定：根據(jù)Genebank收錄的豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因保守序列，設(shè)計(jì)合

8、成1對(duì)引物，對(duì)血清Ⅰ型豬胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至 pMD-18T，經(jīng)轉(zhuǎn)化與鑒定后，送至大連寶生物公司測(cè)序，結(jié)果顯示：該引物對(duì)血清Ⅰ型豬胸膜肺炎放線桿菌可擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致(約為620bp)的特異性 DNA條帶；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的重組pMD-18T載體進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定結(jié)果均正確(分別約為624bp和624bp/2700bp)；經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增片段大小為624bp，該片段序列與Genebank上參考菌株相應(yīng)序列的同

9、源性達(dá)100％。
　　5．豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因原核表達(dá)及其初步鑒定：將上述擴(kuò)增 ApxⅣ基因片段克隆至 pET32a載體，轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫反應(yīng)性鑒定，結(jié)果顯示：經(jīng)藍(lán)白斑菌落篩選和PCR反應(yīng)證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因片段的重組pET32a-ApxⅣ載體；經(jīng)轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，該基因片段的表達(dá)蛋白量達(dá)到全菌蛋白的22％，最