豬傳染性胸膜肺炎血清7型菌株的分離鑒定與體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因的篩選.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起豬的一種高度接觸性傳染病，該病嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究就其分離鑒定與血清7型菌株體內(nèi)誘導(dǎo)基因篩選作了以下工作:
　　1.APP的分離鑒定
　　本研究從四川某豬場(chǎng)的疑似豬傳染性胸膜肺炎的病豬中分離到一

2、株革蘭氏陰性短桿菌。經(jīng)染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR檢測(cè)、血清型檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)等鑒定，結(jié)果表明分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果與多數(shù)APP分離株的一致，采用PCR可擴(kuò)增出約450bp左右的APP特異性目的條帶，利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定為7型，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該分離株對(duì)大多數(shù)藥物都比較敏感，僅對(duì)林可，霉素耐藥。綜合判定該分離株為豬APP的7型菌株。
　　2.APP7基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建
　　本研究用pET28a/b/c載體構(gòu)建表

3、達(dá)文庫(kù)。提取APP血清7型的基因組DNA，經(jīng)Sau3AⅠ經(jīng)行不完全酶切，回收0.5～2 kb的DNA片段。純化后的DNA片段與經(jīng)具有相同酶切位點(diǎn)的BamHⅠ單酶切及CIAP去磷酸化處理的pET28a/b/c質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用含有卡那抗性的LB平板篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。隨機(jī)挑選部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，結(jié)果顯示插入片段在0.5～2kb的范圍內(nèi)，重組陽(yáng)性率大于85％，共收集陽(yáng)性克隆約26000個(gè)，

4、大于理論計(jì)算值，符合文庫(kù)要求，表明文庫(kù)構(gòu)建成功。
　　3.基因組表達(dá)文庫(kù)的篩選
　　采用原位免疫印跡技術(shù)對(duì)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選:表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)化菌液稀釋后均勻涂布于含有kan抗性的LB平板，每個(gè)平板含300～500個(gè)菌落，37℃培養(yǎng)10h后將菌落影印至滅菌硝酸纖維素膜(NC膜)上。帶菌NC膜轉(zhuǎn)移至含kana和IPTG的LB平板37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，用氯仿蒸汽作用15 min以裂解細(xì)菌釋放蛋白。NC膜用10％脫脂奶粉封閉過(guò)夜，并依次與