豬鏈球菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌及其部分血清型多重PCR方法的建立.pdf

1、豬鏈球菌（Streptcococcus suis，SS）、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP）和副豬嗜血桿菌（Haemophilus Parasuis，HPS）分別是引起豬鏈球菌?。⊿wine strepococosis），豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae，PCP）和格拉瑟氏病（Gl?sser’s disease）的主要病原，也

2、是養(yǎng)豬業(yè)常見的三種細(xì)菌性病原菌。這三種病原菌均有多個(gè)血清型，主要侵害幼齡仔豬和保育豬，引起一系列呼吸道癥狀，導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率，且在臨床上鑒別難度較大，給全球生豬養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究基于豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶（gdh）基因，胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素（Apx IV）基因，副豬嗜血桿菌16S r RNA基因序列建立了豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌三重PCR方法；基于豬鏈球菌cps1J、cps2J、cps

3、7H、cps9H基因序列建立豬鏈球菌血清1、2、7、9型多重PCR方法；基于豬胸膜肺炎放線桿菌血清cps1B、cps9D、cps5B、cps2D型和Apx IV毒素基因序列建立豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1、3、5、7型及ApxIV多重PCR方法；基于豬胸膜肺炎放線桿菌Hypb、cps6D、cps8A、cps1A基因序列建立豬傳染性胸膜肺炎血清2、6、8、12型多重PCR方法，研究結(jié)果表明，本研究建立的四套多重PCR的重復(fù)性，特異性和敏

4、感性較好，通過本方法對一些臨床樣品進(jìn)行了檢測，其結(jié)果與單一PCR檢測結(jié)果一致。
　　SS、APP和HPS三重PCR方法的建立：本研究針對豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶（gdh）基因，豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素（Apx IV）基因，副豬嗜血桿菌16S r RNA基因序列各設(shè)計(jì)1對特異性引物，分別能擴(kuò)增出gdh688bp、Apx IV417bp和16S rRNA822bp的DNA片段，將三對引物置于25μL體系進(jìn)行優(yōu)化，找出最優(yōu)反應(yīng)體系，并經(jīng)酶

5、切鑒定，確定目的片段得到了正確擴(kuò)增。重復(fù)性特異性實(shí)驗(yàn)表明：該實(shí)驗(yàn)具有很好的重復(fù)性，對多殺性巴氏桿菌、豬大腸桿菌、豬放線桿菌、豬葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬沙門氏菌等具有特異性。敏感性實(shí)驗(yàn)表明：最低可檢測到的細(xì)菌含量為：SS104CFU/mL；APP103CFU/mL；HPS103CFU/mL。人工模擬實(shí)驗(yàn)對SS、APP、HPS的敏感性均為104CFU/mL。對采集的30份疑似病例細(xì)菌分離細(xì)菌分離鑒定后，用本研究建立的三重PCR及細(xì)菌分離方法

6、進(jìn)行檢查，結(jié)果表明，該三重PCR方法靈敏度與常規(guī)細(xì)菌分離方法符合率達(dá)到93％。證明本實(shí)驗(yàn)建立的SS、APP和HPS的三重PCR方法在檢測上述三種疾病方面具有應(yīng)用價(jià)值。
　　SS血清1、2、7、9型多重PCR方法的建立：針對SS血清1、2、7、9型的莢膜多糖合成相關(guān)基因（CPS）序列各設(shè)計(jì)1對特異性引物，分別能擴(kuò)增出550bp、675bp、150bp和300bp的DNA片段，將四對引物置于25μL體系進(jìn)行優(yōu)化，找出最優(yōu)反應(yīng)體系，并經(jīng)

7、酶切鑒定，確定目的片段得到了正確擴(kuò)增。重復(fù)性，特異性實(shí)驗(yàn)表明：該實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性，對豬丹毒桿菌、豬大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、葡萄球菌、豬放線桿菌、豬沙門氏菌DNA模板PCR擴(kuò)增，均無特異性條帶。對豬鏈球菌野毒株提取DNA模板，分別使用本多重PCR方法和細(xì)菌分離方法檢測，將檢測結(jié)果做比較，結(jié)果顯示符合率達(dá)100%。本四重PCR方法快速有效，可在3小時(shí)左右得到檢測結(jié)果。
　　APP血清1、3、5、

8、7型及Apx IV多重PCR方法的建立：針對APP血清1、3、5、7型的cps基因及APP種屬Apx IV基因序列各設(shè)計(jì)1對特異性引物，分別能擴(kuò)增出959bp、520bp、825bp、600bp和417bp的DNA片段，將五對引物置于25μL體系進(jìn)行優(yōu)化，找出最優(yōu)反應(yīng)體系，并經(jīng)酶切鑒定，確定目的片段得到了正確擴(kuò)增。重復(fù)性，特異性實(shí)驗(yàn)表明：該實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性，建立的五重PCR方法能對同一樣品中的APP血清1、3、5、7型及APP的DN

9、A模板進(jìn)行擴(kuò)增，均無交叉反應(yīng)。對豬大腸桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬丹毒桿菌、豬沙門氏菌DNA模板PCR擴(kuò)增，均無特異性條帶。對APP血清1-15型DNA模板PCR擴(kuò)增，所有血清型均可擴(kuò)增出Apx IV的特異性條帶，且除APP血清1、3、5、7型可以擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶，其他血清均只能擴(kuò)增出Apx IV的特異性條帶。對APP血清1、3、5、7型及Apx IV的檢測敏感性皆為103CFU/mL。本五重PCR方法快速有

10、效，可在3小時(shí)左右得到檢測結(jié)果。
　　APP血清2、6、8、12型多重PCR方法的建立：針對APP血清2、6、8、12型的莢膜多糖合成相關(guān)基因(CPS)序列各合成1對特異性引物，分別能擴(kuò)增出247bp、718bp、1106bp和347bp的DNA片段，將四對引物置于25μL的體系通過單一PCR和四重PCR體系條件的優(yōu)化，找出最優(yōu)反應(yīng)體系，并經(jīng)酶切鑒定，確定目的片段得到了正確擴(kuò)增。重復(fù)性，特異性實(shí)驗(yàn)表明：該實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性，建立

11、的四重PCR方法能對同一樣品中的APP血清2、6、8、12型的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，均無交叉反應(yīng)。豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、豬大腸桿菌、DNA模板PCR擴(kuò)增，均無特異性條帶。對APP血清1-15型基因組DNA模板PCR擴(kuò)增，除APP血清2、6、8、12型可以擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶外均不能擴(kuò)增出任何特異性條帶。對APP血清2、6、8、12型的檢測敏感性皆為103CFU/mL。人工模擬實(shí)驗(yàn)對SS、APP、HPS的敏感性均為10