攜帶PRRS病毒ORF5基因胸膜肺炎放線桿菌載體的構(gòu)建及特性鑒定.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎的呼吸道病原細菌；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)可引起一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的烈性傳染病。這兩種病原均為當前公認的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染性病原。本文在APP基因缺失突變致弱菌株構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，將PRRSV基因組中編碼保護性抗原的ORF5基因片段插入APP基因缺失區(qū)，構(gòu)建攜帶異源基因的APP細菌載體。本試驗結(jié)果將為研制可同時預(yù)防APP和PRRSV這兩種病原感染的細

2、菌減毒活疫苗奠定堅實的基礎(chǔ)。 首先利用原核表達系統(tǒng)對PRRSV-ORF5基因片段進行表達分析以鑒定可在細菌中表達的抗原表位。利用PCR方法分別擴增ORF5基因缺失信號肽的D片段、缺失信號肽和跨膜區(qū)的L片段、缺失信號肽的5’端N片段和缺失跨膜區(qū)的3’端C片段，經(jīng)克隆測序后分別插入原核表達載體pET-32a中進行表達，結(jié)果顯示未缺失跨膜區(qū)的D片段未見表達產(chǎn)物，而L片段、N片段和C片段分別表達大小約為33 kDa、25 kDa和29

3、kDa的融合蛋白。Western blotting檢測結(jié)果顯示L片段表達蛋白可與PRRSV陽性血清發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，C片段反應(yīng)性稍弱，而N片段未出現(xiàn)陽性反應(yīng)。結(jié)果證實含有跨膜區(qū)的OKF5基因片段不能良好表達，C端在與GP5抗體結(jié)合方面具有重要作用。 在ORF5基因不同功能區(qū)表達分析的基礎(chǔ)上將ORF5基因片段(L)分別插入apxlA或apxlC基因缺失區(qū)以構(gòu)建不同的突變菌株。利用雙酶切分別自重組質(zhì)粒pTAIJ、pT-ORF5L、pTC

4、hl<'r>和pTAD中切出1.8 kb的AU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chl<'r。和1.7kb的AD基因片段，將上述基因片段串聯(lián)并插入pUC19的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pULA-L-Chl<'r>。用同樣的方法分別自重組質(zhì)粒pTCU、pT-ORF5L、pTChl<'r>和pTCL中切出2.2 kb的CU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chl<'r>和1.8 kb的CL基因片段，將上述基因片段串聯(lián)并插入p

5、UC19的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pUIC-L-Chl<'r>。將兩種轉(zhuǎn)移載體經(jīng)電轉(zhuǎn)化分別導(dǎo)入胸膜肺炎放線桿菌血清10型野生菌株中進行同源重組，篩選獲得兩種突變菌株。利用PCR和Southern Blotting對突變菌株進行了鑒定，并對突變菌株生物學(xué)特性進行了分析。結(jié)果表明，ORF5基因片段已成功導(dǎo)入突變菌株中，兩種突變菌株均可正常增殖，連續(xù)傳代后插入的Chl<'r>和ORF5基因片段可穩(wěn)定遺傳，與母源菌株相比毒力降低100倍以上，