胸膜肺炎放線桿菌五基因缺失疫苗菌株構(gòu)建及生物學特性分析.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬的接觸傳染性呼吸道疾病，主要引起肺的纖維性滲出、壞死性肺炎及肺膜的增厚炎性滲出，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 目前疫苗接種仍然是預防控制該病的主要措施，因而獲取一種針對胸膜肺炎放線桿菌安全、高效、具備良好的交叉保護力

2、的疫苗擁有極大的前景。弱毒活疫苗免疫動物后可誘導機體產(chǎn)生免疫力，可獲得一定的對異型血清型菌的交叉保護力。主要研究內(nèi)容如下。
　　 1、五基因缺失疫苗菌株構(gòu)建及生物學特性的研究本研究通過接合轉(zhuǎn)移和同源重組等方法在四基因缺失疫苗菌株CH04（△apxⅠC/△apxⅡC/△apxⅣ-orf1/△cpxAR）的基礎上，進一步敲除了arcA雙組份基因，成功構(gòu)建五基因缺失疫苗菌株YWJ05(△apxⅠC/△apxⅡC/△apxⅣ-orf1/

3、△cpxAR/△arcA)，生長速率結(jié)果表明:較之CH04和APP血清1型野毒（WT，下同）菌株，YWJ05菌株的生長速率下降不顯著。在體外采用PK-15細胞進行粘附和侵入試驗，在肺泡巨噬細胞內(nèi)檢測細菌的抗吞噬能力，運用中心粒細胞介導殺傷試驗(PMN)來了解兩個突變株的抗殺傷能力的不同，細胞試驗的結(jié)果表明:YWJ05菌株的抗殺傷能力低于CH04菌株。
　　 2、五基因缺失疫苗菌株對小鼠毒力分析為了比較關(guān)于兩個突變株對小鼠毒力差異

4、，每個菌使用四個濃度，每個稀釋度腹腔接種6只Balb/C小鼠，每只200μL，然后通過統(tǒng)計各突變株感染小鼠后10天后的存活數(shù)量，計算LD50。LD50結(jié)果表明YWJ05菌株的毒力相對于CH04菌株，差異不顯著，但較之野毒，下降則極為顯著。
　　 3、五基因缺失疫苗菌株對小鼠免疫保護力研究為了解淋巴細胞的增殖情況，我們提取二免后七天小鼠的脾臟來進行淋巴細胞增殖試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YWJ05疫苗菌株免疫組OD490比值明顯低于CH04疫苗

5、菌株免疫組，取二免7天后小鼠血清和WT孵育，再與空白小鼠全血作用，發(fā)現(xiàn)YWJ05組殺傷率明顯高于CH04組，說明YWJ05菌株誘導抗體的表達有相當程度地提高。通過ELISA檢測免疫后14、28天小鼠血清中的ApxⅣA抗體，結(jié)果YWJ05組的抗體滴度高于CH04，這與全血殺菌的結(jié)果吻合。
　　 對二免后7天小鼠血清進行抗體分型檢測，結(jié)果兩個疫苗菌株都呈現(xiàn)IgG1抗體水平明顯高于IgG2a，這表明突變株在體內(nèi)主要引起Th2型為主的免

6、疫反應。再通過檢測淋巴細胞培養(yǎng)上清細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)兩個突變株組的IL-6、TNF-α水平都有明顯提高，而且突變株組的IL-6的表達上升比值都高于TNF-α的表達上升比值，說明兩個突變株在小鼠體內(nèi)激發(fā)體液免疫反應，這與抗體分型的結(jié)果一致。
　　 在二免后14天，以APP血清1型野毒株3×107CFU(30LD50)攻毒，觀察14天，記錄下每組的死亡情況，發(fā)現(xiàn)CH04、YWJ05組的免疫保護率都高達100％，說明在敲除了arcA基