2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌,引起豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。APP是豬呼吸道的專性寄生菌,通過空氣和直接接觸來傳播。由于APP血清型眾多,各血清型之間交叉保護力較低,傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗的效果均不理想。因此,迫切需要更安全、高

2、效的新型疫苗來預(yù)防和控制該傳染病的發(fā)生與流行。
   毒力因子的全面鑒定是病原菌致病機理研究和防治產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。信號標簽誘變(signature-tagged mutagenesis,STM)是一種經(jīng)過優(yōu)化的經(jīng)典的轉(zhuǎn)座子突變技術(shù),可以用含多個序列標簽的轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病原菌的突變體庫,通過宿主或?qū)嶒瀯游飦碡撓蚝Y選致弱突變體,進而鑒定相關(guān)基因。自1995年首次建立以來,STM技術(shù)被廣泛用于多種病原菌毒力相關(guān)基因的發(fā)掘與鑒定。
 

3、  很多病原菌為了適應(yīng)體內(nèi)外的環(huán)境會形成生物被膜(biofilm)。大量的研究表明,生物被膜的形成與病原菌的免疫逃避和抗藥性有關(guān),是影響感染的重要因素。本研究構(gòu)建了APP血清1型的STM突變體庫,從中篩選到2個生物被膜形成突變菌株,對突變基因進行了定位和克隆,對突變菌株的生物學(xué)特性進行了研究,為闡明APP生物被膜的形成機制提供了一定的試驗數(shù)據(jù)。
   1.APP血清1型STM突變體庫的構(gòu)建
   以APP血清1型萘啶酸

4、抗性菌株4074-N為受體菌,以攜帶mini-Tn10的標簽質(zhì)粒(pLOF/TAG1-48)的E.coli CC118λ pir或Sm17-1λ pir為供體菌,在或不在E.coli DH5α(pRK2073)的輔助下,進行三親本或兩親本接合,通過轉(zhuǎn)座子內(nèi)攜帶的卡那霉素抗性篩選、氨芐青霉素負篩選、PCR和Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)座突變株。在APP與E.coli接合實驗中,通過對兩親本接合與三親本接合進行了比較,證明了兩親本接合的效率明

5、顯高于三親本接合。用兩親本接合方法,構(gòu)建了32個STM標簽的APP突變體庫,共得到1652個轉(zhuǎn)座突變菌株(每個標簽不少于50個突變體)。
   2.APP生物被膜形成突變體的篩選及插入失活基因的鑒定
   用96孔板法和試管法從上述APP血清1型4074-N株(不產(chǎn)生生物被膜)STM突變體庫中篩選到兩株能產(chǎn)生很強生物被膜的突變體,即STM1-21和STM6-42。提取突變體的基因組用轉(zhuǎn)座子內(nèi)的SspⅠ酶切后進行自連接。以

6、連接產(chǎn)物為模板,用轉(zhuǎn)座子上的特異性引物STM10/11和STM10/12,通過反向PCR擴增,獲得轉(zhuǎn)座子插入位點兩側(cè)的基因片段。經(jīng)DNA測序和BLAST分析,發(fā)現(xiàn)這兩株突變體均為Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子插入失活編碼一種類組氨酸核結(jié)構(gòu)蛋白(Histone-like nucleoid structuring protein)的hns基因造成的。PCR和Southern雜交進一步確定了插入突變體的正確性。
   3.APP H-NS的

7、結(jié)構(gòu)與功能的初步研究
   APP的hns基因編碼一種135個氨基酸的類核結(jié)構(gòu)蛋白H-NS,主要由三個結(jié)構(gòu)域組成,即N端的聚合結(jié)構(gòu)域、C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和中間的柔性連接片段。通過N端的聚合結(jié)構(gòu)域形成多聚體結(jié)構(gòu),C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶基因結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用。
   為了研究APP的hns基因的功能,將4074-N株的hns基因表達盒(包括其編碼區(qū)、啟動子和終止子序列)克隆到能穿梭質(zhì)粒pJN105中,構(gòu)建了一個重組表

8、達質(zhì)粒pJN-hns,分別電轉(zhuǎn)化到hns轉(zhuǎn)座突變菌株STM1-21(M)和親本菌株4074-N(P)中,期望獲得互補菌株(C-3)和過表達菌株(O-2);然后比較分析了上述四個菌株P(guān)、M、C-3和O-2的生長特性、生物被膜形成和毒力的變化,結(jié)果表明:4個菌株的體外生長速度未見明顯差異;除突變菌株M外,其它3個菌株均不能形成可測的生物被膜;菌株M、C-3和O-2對小鼠的毒力和溶血活性均有不同程度的減弱?;パa菌株和過表達菌株的上述表型均與預(yù)

9、期的結(jié)果不一致。為了進一步解釋這種現(xiàn)象,我們通過實時熒光定量RT-PCR分析了上述4個菌株中hns基因及兩種重要毒力基因axpⅠA和axpⅡA的表達情況。結(jié)果顯示,hns基因在C-3和O-2菌株中均有表達,但表達量均比親本菌株P(guān)還要低,提示H-NS的缺失在C-3株中并沒有得到有效互補,H-NS也沒有在O-2株中過表達,C-3和O-2均表現(xiàn)為hns的下調(diào)表達菌株,這可能是因為hns基因的表達存在自調(diào)控機制,這種表達自調(diào)控機制在大腸桿菌中已

10、有報道。此外,axpⅠA和axpⅡA的表達下調(diào)也初步解釋了菌株M、C-3和O-2的毒力與溶血活性減弱現(xiàn)象。為了進一步研究H-NS蛋白對APP生物被膜形成的影響,本實驗以APP血清1型4074株基因組DNA為模板,PCR擴增了408 bp的hns基因編碼區(qū),克隆到原核表達載體pET-28c中獲得重組質(zhì)粒pET28c-hns,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和組氨酸親和層析柱純化獲得大小

11、約19 kD的重組蛋白rH-NS。將不同濃度的rH-NS添加到hns突變株1-21及其親本菌株4074的培養(yǎng)基中,用微孔板法測定生物被膜的形成。結(jié)果顯示,在不添加rH-NS時,4074株不能形成可見的生物被膜,而1-21株形成明顯的生物被膜;在添加0.1~0.3μmol/L的rH-NS的情況下,1-21株生物被膜的形成量隨著rH-NS濃度的升高而降低,而4074株隨著rH-NS濃度的升高而升高;rH-NS添加量超過0.4μmol/L對兩

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