胸膜肺炎放線桿菌質(zhì)粒的序列測定與分析.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actunibacullus pleroroplneumoniae，APP)屬于革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧生長。胸膜肺炎放線桿菌可以引起豬的傳染性胸膜肺炎，能引起各個(gè)年齡的豬發(fā)生急性和慢性感染，以肺出血、壞死和纖維素性滲出為主要病變。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，近幾年來該病的發(fā)生呈上升趨勢，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了解決這一問題，需要從分子生物學(xué)水平更深入地開展研究。 應(yīng)用堿裂解方法，對APP2、APP7與APP9三株

2、細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒抽提，從APP2與APP9中獲得了質(zhì)粒。我們采用EcoRI限制性酶切，膠回收酶切片斷、與同樣酶切的載體pBS連接，得到的陽性克隆用M13通用引物雙向測序。然后用引物延伸(Primet.walking)的方法，測定整個(gè)質(zhì)粒的序列。分析結(jié)果顯示，APP2菌中含有2個(gè)大小不等的質(zhì)粒，分別命名為pAPP2-7與pAPP2-8，大小分別為4.7kb、9.6kb。說明APP2菌中含有兩個(gè)相容的質(zhì)粒pAPP2-7與pAPP2-8。

3、 對質(zhì)粒pAPP2-7和質(zhì)粒pAPP2-8進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括質(zhì)粒全序列的G+C含量與重復(fù)序列分析；ORF的搜索、ORF的同源性比較、ORF的CDS的功能；以及氨基酸密碼子的傾向性分析等。質(zhì)粒pAPP2-7全長為4722bp，質(zhì)粒pAPP2-8全長為9569bp，G+C含量分別為31.58％、32.0％。在每個(gè)質(zhì)粒上存在著大小不等的反向重復(fù)和正向重復(fù)序列，這些重復(fù)序列散落分布，遍布整個(gè)質(zhì)粒，可能對質(zhì)粒的復(fù)制起著重要的作用。ORF分析

4、表明，質(zhì)粒pAPP2-7上存在著三個(gè)主要的ORF，分別編碼MobA、MobC及Rep蛋白；質(zhì)粒pAPP2-8上也存在著分別編碼Mob-Pre，Rep_3和Transposase_27的3個(gè)主要ORF。隨后對ORF氨基酸密碼子的傾向性進(jìn)行了分析。 為了構(gòu)建胸膜肺炎放線桿菌一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體，對質(zhì)粒pAPP2-7 ORF之外的序列BlastN比對、分析，推測質(zhì)粒pAPP2-7的復(fù)制子，包括質(zhì)粒的復(fù)制起始蛋白以及其上游的一段序列，

5、大小為2.7Kb；用一對帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增該片斷，與pMD-18 T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，氨芐平板篩選，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切和PCR鑒定，獲得陽性重組子pAPP2-MD。EcoRI雁限制性酶切質(zhì)粒pAPP2-MD，回收酶切產(chǎn)物，與同樣酶切的帶有大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)的Kan<'r>基因連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑取克隆子，獲得陽性重組子pAPK2，轉(zhuǎn)化胸膜肺炎放線桿菌血清7型受體菌，抽提質(zhì)粒得到pAPK2