胸膜肺炎放線桿菌RTX毒素與宿主細(xì)胞相互作用的初步研究.pdf

1、由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)引起的豬傳染性胸膜肺炎造成了世界養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失,其最重要的毒力因子之一是胸膜肺炎放線桿菌外毒素(Apx)。Apx毒素屬于RTX毒素家族,是Ca2+依賴性的溶血素,有的還同時(shí)具有細(xì)胞毒素作用。到目前為止,已經(jīng)在胸膜肺炎放線桿菌的15個(gè)血清型菌株中發(fā)現(xiàn)了四種Apx毒素,即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。Apx霉素一般由C、A、B、D四個(gè)基因組成

2、的操縱子編碼,A基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白并能被C基因的編碼產(chǎn)物激活,B和D基因的編碼產(chǎn)物參與毒素蛋白的分泌。
　　 由RTX毒素引發(fā)的細(xì)胞死亡主要有兩種方式,即細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。以往的研究表明,高濃度的RTX毒素能導(dǎo)致靶細(xì)胞迅速死亡并伴隨細(xì)胞壞死的特征,而當(dāng)靶細(xì)胞接觸低濃度的RTX毒素時(shí)呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的的形態(tài)學(xué)、生化和分子變化特征。由于Apx的復(fù)雜性,Apx與靶細(xì)胞之間的相互作用目前還不清楚。本論文初步研究了ApxⅠ、ApxⅡ與豬外周

3、血白細(xì)胞、豬肺上皮細(xì)胞之間的相互作用。
　　 Apx毒素引起豬外周血白細(xì)胞凋亡:利用常規(guī)方法提取豬胸膜肺炎放線桿菌血清10型的天然毒素ApxⅠ和血清7型的天然毒素ApxⅡ,并制備了重組蛋白rApxⅠA。分別設(shè)置天然毒素ApxⅠ組、天然毒素ApxⅡ組、重組蛋白rApxⅠA組、三種蛋白的caspase廣譜抑制劑組、三種蛋白的caspase-3抑制劑組以及三種蛋白的caspase-9抑制劑組,然后分別設(shè)置時(shí)間梯度和濃度梯度,作用于豬外

4、周血白細(xì)胞,用DNA ladder方法檢測(cè)其凋亡并分析其凋亡途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ApxⅡ引起的白細(xì)胞凋亡是通過caspase-9和caspase-3共同激活途徑,而ApxⅠ毒素和重組蛋白rApxⅠA在較低濃度時(shí)未能引起白細(xì)胞凋亡。
　　 Apx毒素引起豬肺上皮細(xì)胞凋亡:分別設(shè)置天然毒素ApxⅠ組、重組蛋白rAoxⅠA組、兩種蛋白的caspase廣譜抑制劑組、兩種蛋白的caspase-3抑制劑組以及兩種蛋白的caspase-9抑制

5、劑組,然后分別設(shè)置時(shí)間梯度和濃度梯度作用SJPL豬肺上皮細(xì)胞,用DNA ladder方法檢測(cè)其凋亡并分析其凋亡途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ApxⅠ引起SJPL細(xì)胞凋亡是通過caspase-3激活途徑,而rApxⅠA不引起SJPL細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。
　　 抗生素對(duì)ApxⅠ致豬肺上皮細(xì)胞凋亡的影響:以往研究表明,長期在抗生素培養(yǎng)條件下的細(xì)胞常常會(huì)出現(xiàn)生理生化特性的微小變化。為了研究此現(xiàn)象是否對(duì)凋亡產(chǎn)生作用,我們將豬肺上皮細(xì)胞分成兩組,一組用