致腎盂腎炎大腸桿菌與細胞相互作用的初步研究.pdf

1、目的： 建立致腎盂腎炎大腸桿菌(pyelonephriticE.colioruropathogenicE.coli，UPEC)粘附細胞模型，了解細胞表面粘附受體分布情況，并檢測膀胱癌EJ細胞感染UPEC132后基因表達譜變化。 方法： 1.細胞培養(yǎng)：非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)、人腎癌細胞系(Ketr-3細胞)、膀胱癌細胞系(EJ細胞)。比較UPEC132對此3種細胞的粘附能力。經(jīng)Giemsa染色觀察UPEC1

2、32粘附后不同細胞的形態(tài)學變化，計數(shù)并統(tǒng)計不同細胞的粘附率及粘附指數(shù)。并進行UPEC132的侵襲試驗，用慶大霉素殺死細胞外菌后計數(shù)胞內(nèi)菌，統(tǒng)計UPEC132對不同細胞的侵襲指數(shù)。同時比較無菌毛代表株E.coliK-12p678-54的粘附及侵襲能力。 2.運用間接免疫熒光法檢測上述3種細胞表面的P菌毛受體，一抗選用抗P1抗體(小鼠單克隆抗體IgM)，二抗為FITC(異硫氰酸熒光素)標記的兔抗小鼠IgM抗體，在熒光顯微鏡下觀察細胞

3、表面熒光特點，比較其受體分布情況。 3.基因芯片檢測膀胱癌EJ細胞感染UPEC132后基因表達譜變化。用Trizol提取EJ細胞總RNA(感染后細胞設為實驗組，未感染細胞設為對照組)，并對總RNA進行濃縮、定量、質(zhì)檢，然后利用cRNA標記方法對樣品進行熒光標記，純化后用于芯片雜交；用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進行芯片掃描，采用LuxScan3.0圖像分析軟件(CapitalBio公司)對

4、芯片圖像進行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號；然后對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進行歸一化；最后以差異為2倍的標準來確定差異表達基因。 結果： 1.UPEC132作用于上述3種細胞1h后，細胞形態(tài)均發(fā)生了明顯改變：細胞間隙變大，胞漿突起收縮，甚至破裂，細胞對培養(yǎng)皿的粘附能力也明顯下降。UPEC132對Vero、Ketr-3及EJ細胞的粘附率分別為(61.44±3.21)％、(55.22±4.09)％及(58.67±5.1

5、2)％，差別無統(tǒng)計學意義；對此3種細胞的粘附指數(shù)分別為1.44±0.06、1.74±0.09和2.27±0.18，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。UPEC132對EJ及Ketr-3細胞的侵襲指數(shù)分別為(3.25±0.20)×10-3、(3.00±0.34)×10-3，兩者之間無統(tǒng)計學差異，但均高于對Vero細胞的侵襲指數(shù)[(2.61±0.32)×10-3，p<0.05]。E.coliK-12p678-54對上述3種細胞無粘附及侵襲能力，細

6、胞形態(tài)未見改變。 2.熒光顯微鏡下實驗組細胞表面呈黃綠色熒光，細胞輪廓清晰，熒光物質(zhì)在細胞表面呈連續(xù)性分布。而對照組未見細胞表面熒光。提示此3種細胞表面存在P菌毛受體。 3.膀胱癌EJ細胞感染UPEC132后的基因表達譜檢測共發(fā)現(xiàn)29個差異表達基因，其中28個基因表達上調(diào)，1個基因表達下調(diào)，這些差異表達基因主要涉及細胞生長與增殖、炎癥反應、細胞凋亡、應激反應、信號轉(zhuǎn)導等方面，表明UPEC132粘附EJ細胞后在多靶點、多層