致腎盂腎炎大腸桿菌體外細(xì)胞粘附的初步研究.pdf

1、目的：建立正常人腎盂移行上皮原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法，進(jìn)行致腎盂腎炎大腸桿菌(pyelonephriticE.colioruropathogenicE.coli，UPEC)粘附特性的研究，并探討UPEC132毒力因子對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用。 方法：采用PCR及復(fù)合PCR方法分別擴(kuò)增并檢測UPEC132的papC，hly及cnf1毒力基因。進(jìn)行溶血試驗(yàn)檢測UPEC132的溶血素。選擇正常人腎臟的腎盂組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，分別比較兩種常用培

2、養(yǎng)方法及含血清培養(yǎng)基(RPMI1640等)與添加成分的無血清培養(yǎng)基(KSFM等)的不同培養(yǎng)基體系的培養(yǎng)結(jié)果，進(jìn)行顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、計(jì)數(shù)、HE染色、鑒定及成功率和污染率的統(tǒng)計(jì)，確定原代培養(yǎng)體系。進(jìn)行UPEC132的細(xì)菌粘附試驗(yàn)，經(jīng)Giemsa染色運(yùn)用顯微鏡攝影技術(shù)觀察UPEC132與正常人腎盂移行上皮原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系(Vero)及人移行上皮癌細(xì)胞系(EJ)粘附后的形態(tài)學(xué)改變，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)15至180分鐘不同時(shí)間段的粘附率及粘附指數(shù)，比

3、較UPEC對(duì)三種細(xì)胞的粘附特性及與宿主細(xì)胞的相互作用。試驗(yàn)中以標(biāo)準(zhǔn)株UPECJ96為陽性對(duì)照，無菌毛代表株E.coliK-12p678-54為陰性對(duì)照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，x2檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果：凝膠電泳結(jié)果顯示UPEC132的papC，hly和cnf1基因片斷擴(kuò)增均為陽性。UPEC132溶血試驗(yàn)為陽性。經(jīng)x2檢驗(yàn)KSFM培養(yǎng)基體系原代培養(yǎng)的成功率高于RPMI1640培養(yǎng)基體系(P＜0.05)，組織塊法原代

4、培養(yǎng)的成功率高于酶消化法(P＜0.01)。鏡下觀察原代細(xì)胞形態(tài)為扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密連接成片生長，呈典型的“鋪路石”狀，符合移行上皮細(xì)胞形態(tài)。原代細(xì)胞經(jīng)角蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，鑒定為移行上皮細(xì)胞。UPEC132與三種細(xì)胞粘附試驗(yàn)的粘附率及粘附指數(shù)均在30分鐘趨于穩(wěn)定，此時(shí)間段的三組均數(shù)分別為68.00與20.27，45.60與16.55，69.60與32.28。UPEC132與細(xì)胞粘附后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，油鏡下觀察

5、細(xì)胞收縮、連接松散、可見胞內(nèi)空泡樣變、胞漿突起減少或消失。UPEC132有的粘附于細(xì)胞表面、細(xì)胞膜沿菌體向內(nèi)凹陷，有的則出現(xiàn)于胞漿及胞核內(nèi)。而無菌毛代表株E.coliK-12p678-54與三種細(xì)胞的粘附率及粘附指數(shù)均為0。 結(jié)論：UPEC132含有papC、hly、cnf1毒力基因。采用組織塊法及KSFM培養(yǎng)基(添加EGF及BPE)可以成功培養(yǎng)出正常人腎盂移行上皮原代細(xì)胞。UPEC132與上述三種細(xì)胞均發(fā)生粘附，在30分鐘內(nèi)基