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1、蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)在生物體內(nèi)與許多重要的正常生理過程密切相關(guān).通過對核糖核酸酶A、溶菌酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的氧化再折疊研究,高音等人首次發(fā)現(xiàn)在此過程中有二聚體或多聚體產(chǎn)生,同時使用蛋白質(zhì)化學(xué)研究方法對蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的化學(xué)本質(zhì)進(jìn)行探討,鑒定出交聯(lián)的化學(xué)鍵有二硫鍵和異肽鍵,并且實驗證實阻斷分子間二硫鍵的形成就能防止分子間異肽鍵的形成;與再折疊相反的去折疊實驗也得到同樣的結(jié)論.由此,我們提出蛋白質(zhì)分子交聯(lián)機(jī)理的三步假說:1)蛋白質(zhì)構(gòu)
2、象包括二級結(jié)構(gòu)的改變,2)形成分子間二硫鍵,3)分子間異肽鍵的形成.實驗結(jié)果顯示分子間二硫鍵的形成對分子間異肽鍵的形成起到極為有效的促進(jìn)作用,且證實除了相同的蛋白質(zhì)分子能交聯(lián),不同的蛋白質(zhì)也可以交聯(lián).為了完善和補(bǔ)充蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)三步假說,本實驗首次以原核生物的硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)、核糖核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)和溶菌酶(Lysozyme)作為實驗材料.把PCR方法克隆的大腸桿菌硫氧還蛋白(TRX)基因和核糖
3、核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)基因插入表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisC,構(gòu)建重組蛋白質(zhì)表達(dá)體系;通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá),應(yīng)用TALON固定化金屬親和層析樹脂純化出重組TRX和RNase HⅡ,將它們和溶菌酶通過熱誘導(dǎo)去折疊方法進(jìn)行體外蛋白質(zhì)分子交聯(lián)實驗;結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)在其臨界溫度反應(yīng)時,出現(xiàn)交聯(lián)二聚化和多聚化現(xiàn)象;這些蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)包括分子間二硫鍵和其他共價鍵(異肽鍵);在去折疊反應(yīng)體系中加入還原劑二硫蘇糖醇(DTT)后,不但沒有分子間二硫鍵
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