基于蛋白質(zhì)反式剪接在大腸桿菌中重組鱟C因子Sushi多肽.pdf

1、細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層上特有的結(jié)構(gòu)，其化學(xué)成分為脂多糖（LPS）。細(xì)菌內(nèi)毒素可引起人體發(fā)熱、休克甚至死亡，但它又普遍存在且不易滅活，對制藥和醫(yī)療器械行業(yè)是一個挑戰(zhàn)，臨床上也有必要應(yīng)用可靠靈敏的內(nèi)毒素檢測試劑來避免內(nèi)毒素帶來的不良反應(yīng)。
　　鱟試劑（LAL/TAL）是國際上至今為止檢測內(nèi)毒素最好的方法，具有簡單、快速、靈敏度高等特點，可檢測出fg（10-15g）級水平的內(nèi)毒素，已被廣泛用于藥物，外科器械、水和食品中內(nèi)毒素

2、檢測。然而由于近年來日益廣泛的鱟資源應(yīng)用，再加上海洋環(huán)境污染等原因，鱟資源瀕臨枯竭，迫切需要開發(fā)鱟試劑的替代品。
　　基因工程成為開發(fā)鱟試劑首選的研究平臺，但由于細(xì)菌壁含有內(nèi)毒素，最經(jīng)濟實用的大腸桿菌系統(tǒng)不容易被利用，蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接技術(shù)應(yīng)運而生，存在于前體蛋白質(zhì)中的內(nèi)含子會在蛋白質(zhì)翻譯后發(fā)生自我剪切，并以天然肽鍵連接兩側(cè)蛋白質(zhì)外顯子形成成熟的蛋白質(zhì)。
　　鱟C因子是鱟血細(xì)胞中一種對內(nèi)毒素具有高親和力的絲氨酸蛋白

3、酶原，可替代鱟試劑用于內(nèi)毒素檢測。鱟C因子N端CES片段中的Sushi區(qū)域是與內(nèi)毒素結(jié)合的關(guān)鍵部位。本文主要介紹了運用蛋白質(zhì)反式剪接的新技術(shù)重組表達鱟C因子Sushi多肽，在特定位點斷開鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段，分別連接到斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX的N端片段(IN)和C端片段(IC)在大腸桿菌中表達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化，復(fù)性以及內(nèi)毒素去除后，體外誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)內(nèi)含子發(fā)生剪切，得到C因子中CES12片段，并檢測其活性。實