大腸桿菌無細胞體系高通量合成蛋白質的探索性研究.pdf

1、與體內合成蛋白質相比，由于無細胞反應體系的開放性，無細胞體外合成蛋白質的一個潛在的重要優(yōu)點是蛋白質合成的高通量性。本文從無細胞反應內在效率的提高、基于目標蛋白質線性模板的無細胞反應、DNA凝膠輔助的無細胞反應、無細胞反應器微型化及噴墨打印技術等多個角度研究了無細胞體系如何實現(xiàn)高通量蛋白質的合成。
　　首先選擇了枯草芽孢桿菌木聚糖酶作為目標蛋白，研究如何在大腸桿菌無細胞蛋白合成體系實現(xiàn)功能性高效合成。通過對木聚糖酶基因N’端的信號肽

2、序列的突變，采用過量表達了分子伴侶的大腸桿菌制備無細胞抽提物，構建了高效可溶性合成木聚糖酶的無細胞體系，并且通過在無細胞反應體系中添加表面活性劑Triton X-100制備高活性的成熟木聚糖酶。結合優(yōu)化無細胞反應條件，無細胞體系中表達的木聚糖酶的活性最終提高了6.1倍。這一組合表達策略成功應用于其它四種具有代表性的重要的工業(yè)酶（包括堿性磷酸酶、葡萄糖脫氫酶、青霉素G酰基轉移酶以及脂肪酶）的體外無細胞表達，與常規(guī)的無細胞蛋白表達結果相比，

3、這四個酶的整體表達的水平均獲得了從3.2倍到5.3倍不等的增加。
　　在無細胞蛋白合成體系中，以線性PCR產(chǎn)物為模板是實現(xiàn)高通量合成蛋白質的一個基本策略。然而，由于無細胞體系中核酸酶的存在，線性模板極易降解，從而導致無細胞表達效率低。本文引入了DNA凝膠技術，將線性目標基因模板交聯(lián)固定在凝膠內部，從而提高以線性目標基因片段為表達模板時無細胞反應的效率。我們對DNA凝膠的制備方法進行了改進，開發(fā)了基于乳液原理的高通量制備直徑為微米級

4、DNA凝膠微粒的新技術?；诖薉NA凝膠微粒的固相無細胞表達模式下，木聚糖酶表達效率與傳統(tǒng)的直接添加DNA模板的液相反應體系相比提高了近十倍，有效提高了以線性DNA片段為表達模板時的無細胞表達效率。在此基礎上，進一步考察了兩種更為穩(wěn)定而有效的方法，包括沖擊混合與膜過濾技術，最終可得到粒度平均分布僅為3μM的DNA凝膠微粒。
　　在DNA凝膠微顆粒與無細胞蛋白合成體系的基礎上，結合脂質體的制備方法，我們建立了一種高通量制備微米級微型

5、生物反應器的方法。通過我們的方法所獲得的“人工細胞”（微型生物反應器）具有磷脂雙分子層的外膜結構以及固定了目標基因模板的DNA凝膠內核，中間部分則是用于蛋白合成的無細胞表達體系。該“人工細胞”反應器不僅有助于研究微體系下高效率的無細胞蛋白表達，尤其是膜蛋白的無細胞表達，而且整個系統(tǒng)從結構到功能上都模擬了真正的細胞，因而具有極其重要的合成生物學意義。
　　最后，研究了商業(yè)化打印機作為一種高通量反應技術在高通量分散生物樣品中的基本規(guī)律