轉(zhuǎn)基因成分高通量檢測(cè)體系-微流體蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建.pdf

1、近年來隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種類和種植面積的逐年增加，轉(zhuǎn)基因隨之帶來的安全問題也日益引人注目，對(duì)轉(zhuǎn)基因的監(jiān)管已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展過程中的重要任務(wù)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法主要針對(duì)單一或少量轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的檢測(cè)，但隨著轉(zhuǎn)基因種類的增多，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不僅消耗時(shí)間和人力，而且不能滿足從未知樣品中檢測(cè)出所有可能存在的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)。鑒于此，研發(fā)高通量的檢測(cè)技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。當(dāng)前的轉(zhuǎn)基因高通量檢測(cè)技術(shù)主要基于核酸物質(zhì)

2、，而基于蛋白質(zhì)的高通量檢測(cè)技術(shù)尚未得到很好的發(fā)展。本文以微流體核酸芯片為基片，通過核酸雜交固定抗體探針，構(gòu)建了一種新型的微流體蛋白質(zhì)芯片，并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，以期為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供一種快速、靈敏的高通量分析平臺(tái)。本論文的主要結(jié)果如下：
　　 1.抗體-寡核苷酸的交聯(lián)及交聯(lián)物性質(zhì)分析
　　 本文通過對(duì)抗體和寡核苷酸進(jìn)行基團(tuán)修飾，而后經(jīng)雙苯腙鍵生成對(duì)兩者進(jìn)行交聯(lián)的化學(xué)方法合成抗體.寡核苷酸交聯(lián)物。在此基礎(chǔ)上，采用UV/v

3、is，SDS-PAGE等方法對(duì)交聯(lián)的反應(yīng)、純化、封閉等步驟進(jìn)行跟蹤分析，并對(duì)最終的交聯(lián)物進(jìn)行鑒定，以此確定成功合成抗體.寡核苷酸交聯(lián)體的優(yōu)化方案。研究結(jié)果表明，經(jīng)紫外光譜分析和比爾-朗伯定律計(jì)算測(cè)量得到平均每個(gè)抗體上結(jié)合了3-4條寡核苷酸；通過ELISA方法對(duì)交聯(lián)過程中抗體活性的變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明基團(tuán)修飾后的抗體活性沒有受到大的影響，而寡核苷酸結(jié)合后的抗體與抗原結(jié)合的效率有所下降，原因可能由核酸的空間干擾引起。
　　 2.抗

4、體在μParafloTM寡核苷酸芯片上的固定
　　 合成針對(duì)6種不同轉(zhuǎn)基因蛋白的抗體.寡核苷酸交聯(lián)體，通過將交聯(lián)體與微流體芯片表面的寡核苷酸探針雜交的方式將抗體固定到芯片表面，通過Cy3標(biāo)記二抗與已固定抗體結(jié)合來顯示抗體在芯片表面上固定的位置。通過對(duì)雜交條件的優(yōu)化，得到高特異性的雜交條件，即含25％甲酰胺雜交稀釋緩沖液，30℃下與芯片表面雜交2 h，然后用含0.2％SDS的雜交洗滌液洗去多余交聯(lián)體。采用不同濃度的交聯(lián)體與芯片表面

5、的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，用同等濃度轉(zhuǎn)基因蛋白溶液進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，最終確定以50 nM作為最優(yōu)的交聯(lián)體雜交濃度。
　　 3.轉(zhuǎn)基因蛋白的芯片檢測(cè)
　　 通過對(duì)不同條件下，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白獲得的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，確定以4℃過夜孵育作為抗原結(jié)合條件。在此基礎(chǔ)上，用優(yōu)化的交聯(lián)體雜交方法合成蛋白質(zhì)芯片，對(duì)6種不同轉(zhuǎn)基因蛋白進(jìn)行梯度濃度試驗(yàn)，結(jié)果表明大部分抗原的檢測(cè)限位于0.1-0.5 ng/mL。將該結(jié)果與ELIS

6、A檢測(cè)結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)芯片的靈敏度與ELISA相當(dāng)；對(duì)于部分ELISA檢測(cè)結(jié)果較差的樣品，芯片的檢測(cè)效果顯著提高。上述結(jié)果表明本研究合成的蛋白質(zhì)芯片能夠適用于轉(zhuǎn)基因蛋白的檢測(cè)。
　　 4.探針的再生和基片的重復(fù)使用
　　 根據(jù)核酸雙鏈解離原理將抗體探針從芯片表面去除，使蛋白質(zhì)芯片重新回復(fù)到核酸芯片狀態(tài)。采用同樣的抗體固定方法在原有的核酸芯片表面再次合成蛋白質(zhì)芯片，在再生芯片上進(jìn)行同等條件下的抗原檢測(cè)試驗(yàn)，比較再生后的芯片與