大腸桿菌cDNA文庫的建立及與RNaseⅢ有相互作用蛋白的篩選.pdf

1、分類號學(xué)校代碼!Q5壘2密級學(xué)號2Q!lQ21壘13Q魚大腸桿菌cDNA文庫的建立及與RNaseIII有相互作用蛋白的篩選ConstructionofacDNALibraryofEcoliandscreeningofproteinsinteractwithRNaseIII研究生姓名肖些指導(dǎo)教師姓名、職稱囪丞鹽熬援湖南師范大學(xué)學(xué)位評定委員會辦公室二零一四年四月cDNA片段，與pTRGXR載體連接后，電擊轉(zhuǎn)入XLl一BLUEMRF’菌電轉(zhuǎn)感

2、受態(tài)中。得到原始文庫，經(jīng)計算文庫的容量達到3106個克隆。用PCR方法測得文庫的重組率為100％，插入片段的平均長度基本位于300bp以上，測定放大文庫的滴度為：3151010pfu／mL。說明構(gòu)建的大腸桿菌eDNA文庫質(zhì)量比較高，適合用于篩選目的基因克隆。文庫的篩選，將pBT-RNaselII質(zhì)粒和pTRGeDNA文庫質(zhì)粒電擊共轉(zhuǎn)入XLlBLUEMRF’篩選菌中。在篩選平板上兩次篩選后得到379個克隆，挑取這379個克隆做菌落PCR，

3、對PCR產(chǎn)物按大小分組后再經(jīng)MSPI酶切，剔除酶切片段一致的克隆，最終得到169個克隆。其中有35個克隆重復(fù)次數(shù)達到三次以上，全部測序后在NCBI中做BLAST比對，發(fā)現(xiàn)大部分的克隆為16SrRNA和23SrRNA，也發(fā)現(xiàn)一些與糖代謝有關(guān)的酶，如吡哆醛激酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、異檸檬酸脫氫酶等，或許細(xì)菌RNaseIII酶也參與細(xì)菌的糖代謝。本次主要研究16SrRNA克隆，在體外經(jīng)GST-PULLDOWN實驗證實RNaseIII和16SrRNA片段