胸膜肺炎放線桿菌LuxS的酶促動力學及抑制劑的篩選.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一種革蘭氏陰性桿菌，屬于巴斯德菌科，引起豬傳染性胸膜肺炎(PorcineContagiouspleuropneumonia,PCP)，是一種高度接觸性傳染性呼吸道疾病。因其的廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。
　　細菌群體感應(QS)是細菌通過分泌自誘導分子(AIs)感應細胞密度和調控基因表達的現(xiàn)象，它控制生物發(fā)光、毒力因子表達、生物被

2、膜的形成等行為。革蘭氏陽性和陰性細菌中存在不同的專一性信號分子調節(jié)多種行為，而LuxS/AI-2系統(tǒng)利用AI-2作為信號分子，在革蘭氏陽性和陰性細菌中都存在，在許多細菌的毒力和代謝中發(fā)揮重要調控功能。另外，AI-2分子的合成酶S-核糖高半胱氨酸酶(LuxS)是活性甲基化循環(huán)(AMC)中一個重要催化酶。在AMC途徑中，LuxS催化S-腺苷高半胱氨酸(SRH)產(chǎn)生高半胱氨酸和AI-2的前體分子DPD。由于LuxS/AI-2系統(tǒng)具有代謝功能和

3、調節(jié)細菌毒力等多種功能，因此，LuxS被認為是很有潛力的藥物靶標。本實驗室的前期研究表明，LuxS直接參與APP的AMC代謝，調控多種毒力因子的表達，而且是APP在宿主體內建立感染所必需的。因此，LuxS可能是抗APP感染的很有潛力的藥物靶標。本研究克隆，表達并純化了APP的LuxS蛋白，在體外建立了LuxS酶活反應體系，研究了LuxS的酶促動力學;基于酶活測定篩選了LuxS酶的抑制劑，測定了這些抑制劑對APP等5種病原菌的抑制活性及對

4、宿主細胞的毒性。
　　1.luxS基因的克隆與LuxS蛋白的表達純化
　　根據(jù)NCBIGenebank中提供的APP4074株的全基因組序列設計引物，以APP4074基因組為模板，采用PCR方法擴增了luxS基因的開放閱讀框，將其連接到了表達載體pET-28a上，并在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細菌中進行了高效表達，菌體蛋白上清用His-Ni2+親和層析柱進行了純化，對表達產(chǎn)物進行了SDS-PAGE和Westem-blo

5、t分析，得到了可溶性的，濃度為1.072mg/ml的純度較高的重組蛋白(25KD)。
　　2.LuxS酶酶促動力學研究
　　采用DTNB顯色法測定LuxS酶促反應產(chǎn)物高半胱氨酸(HCY)，測定了LuxS酶的初速度，確定了其最適反應酶濃度43μg/ml，最適反應時間為5min，最適溫度為50℃，最適pH值為8.0。在最適反應條件下測定了LuxS酶對底物SRH的米氏常數(shù)Km為223.40μM，最大速率Vmax為15.36μM·m

6、in-1。
　　3.基于酶活的LuxS抑制劑的篩選
　　對163個化合物(Specs(Delft，Netherlands))進行了基于LuxS酶活的抑制性初篩，得到了5個抑制效果較好（抑制率＞20％）的LuxS抑制劑，確定了其中4個抑制劑是競爭性抑制劑（48號、75號、135號和150號），分別測定了它們的的抑制常數(shù)Ki(59μM，51μM，176μMand90μM)和半數(shù)抑酶濃度IC50(0.323mM，0.279mM，0

7、.965mMand0.49mM);另外一個抑制劑（146號）是反競爭性抑制劑，無法求得Ki和IC50。
　　4.LuxS抑制劑對細菌抑制活性的檢測
　　對篩選出的5個LuxS抑制劑，用BacTiter-GloTM微生物細胞活性檢測試劑盒檢測活菌數(shù)的方法，分別檢測了它們對胸膜肺炎防線桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，并測定了半數(shù)抑菌濃度(MIC50)，篩選出的150號抑制劑對這5種病原菌均有較好的