胸膜肺炎放線桿菌LuxS的酶促動(dòng)力學(xué)及抑制劑的篩選.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一種革蘭氏陰性桿菌，屬于巴斯德菌科，引起豬傳染性胸膜肺炎(PorcineContagiouspleuropneumonia,PCP)，是一種高度接觸性傳染性呼吸道疾病。因其的廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　細(xì)菌群體感應(yīng)(QS)是細(xì)菌通過(guò)分泌自誘導(dǎo)分子(AIs)感應(yīng)細(xì)胞密度和調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象，它控制生物發(fā)光、毒力因子表達(dá)、生物被

2、膜的形成等行為。革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中存在不同的專一性信號(hào)分子調(diào)節(jié)多種行為，而LuxS/AI-2系統(tǒng)利用AI-2作為信號(hào)分子，在革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中都存在，在許多細(xì)菌的毒力和代謝中發(fā)揮重要調(diào)控功能。另外，AI-2分子的合成酶S-核糖高半胱氨酸酶(LuxS)是活性甲基化循環(huán)(AMC)中一個(gè)重要催化酶。在AMC途徑中，LuxS催化S-腺苷高半胱氨酸(SRH)產(chǎn)生高半胱氨酸和AI-2的前體分子DPD。由于LuxS/AI-2系統(tǒng)具有代謝功能和

3、調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力等多種功能，因此，LuxS被認(rèn)為是很有潛力的藥物靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，LuxS直接參與APP的AMC代謝，調(diào)控多種毒力因子的表達(dá)，而且是APP在宿主體內(nèi)建立感染所必需的。因此，LuxS可能是抗APP感染的很有潛力的藥物靶標(biāo)。本研究克隆，表達(dá)并純化了APP的LuxS蛋白，在體外建立了LuxS酶活反應(yīng)體系，研究了LuxS的酶促動(dòng)力學(xué);基于酶活測(cè)定篩選了LuxS酶的抑制劑，測(cè)定了這些抑制劑對(duì)APP等5種病原菌的抑制活性及對(duì)

4、宿主細(xì)胞的毒性。
　　1.luxS基因的克隆與LuxS蛋白的表達(dá)純化
　　根據(jù)NCBIGenebank中提供的APP4074株的全基因組序列設(shè)計(jì)引物，以APP4074基因組為模板，采用PCR方法擴(kuò)增了luxS基因的開(kāi)放閱讀框，將其連接到了表達(dá)載體pET-28a上，并在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，菌體蛋白上清用His-Ni2+親和層析柱進(jìn)行了純化，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE和Westem-blo

5、t分析，得到了可溶性的，濃度為1.072mg/ml的純度較高的重組蛋白(25KD)。
　　2.LuxS酶酶促動(dòng)力學(xué)研究
　　采用DTNB顯色法測(cè)定LuxS酶促反應(yīng)產(chǎn)物高半胱氨酸(HCY)，測(cè)定了LuxS酶的初速度，確定了其最適反應(yīng)酶濃度43μg/ml，最適反應(yīng)時(shí)間為5min，最適溫度為50℃，最適pH值為8.0。在最適反應(yīng)條件下測(cè)定了LuxS酶對(duì)底物SRH的米氏常數(shù)Km為223.40μM，最大速率Vmax為15.36μM·m

6、in-1。
　　3.基于酶活的LuxS抑制劑的篩選
　　對(duì)163個(gè)化合物(Specs(Delft，Netherlands))進(jìn)行了基于LuxS酶活的抑制性初篩，得到了5個(gè)抑制效果較好（抑制率＞20％）的LuxS抑制劑，確定了其中4個(gè)抑制劑是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（48號(hào)、75號(hào)、135號(hào)和150號(hào)），分別測(cè)定了它們的的抑制常數(shù)Ki(59μM，51μM，176μMand90μM)和半數(shù)抑酶濃度IC50(0.323mM，0.279mM，0

7、.965mMand0.49mM);另外一個(gè)抑制劑（146號(hào)）是反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，無(wú)法求得Ki和IC50。
　　4.LuxS抑制劑對(duì)細(xì)菌抑制活性的檢測(cè)
　　對(duì)篩選出的5個(gè)LuxS抑制劑，用BacTiter-GloTM微生物細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)活菌數(shù)的方法，分別檢測(cè)了它們對(duì)胸膜肺炎防線桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，并測(cè)定了半數(shù)抑菌濃度(MIC50)，篩選出的150號(hào)抑制劑對(duì)這5種病原菌均有較好的