霍亂弧菌體內(nèi)誘導(dǎo)及在海水中生物膜形成相關(guān)基因的篩選與鑒定.pdf

1、霍亂弧菌既是自然水生環(huán)境中的土著性細(xì)菌也是引起人類腹瀉疾病-霍亂的病原體。在自然環(huán)境中霍亂弧菌常常以生物膜的形式附著于生物體或者非生物體表面。生物膜是指附著于物質(zhì)表面由細(xì)菌胞外多糖基質(zhì)包裹的微生物群體，生物膜形態(tài)被認(rèn)為是霍亂弧菌能在自然環(huán)境中長(zhǎng)期存活的重要原因并與霍亂的季節(jié)性爆發(fā)有關(guān)。當(dāng)霍亂孤菌進(jìn)入人體以后，通過調(diào)控一系列體內(nèi)特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因來適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境實(shí)現(xiàn)成功感染。 基于抗生素抗性的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)是一種用于篩選病原菌同宿

2、主相互作用過程中體內(nèi)特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因的方法。本實(shí)驗(yàn)利用一種基于kan-rpsL抗性標(biāo)簽的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)篩選篩選了霍亂弧菌在感染成年小鼠過程中特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因。首先通過轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變法建立了染色體上含無啟動(dòng)子的kan-rpsL抗性標(biāo)簽的突變子文庫，文庫細(xì)胞先通過體外高濃度鏈霉素篩選去除組成型表達(dá)菌株，然后經(jīng)兩輪體內(nèi)體外篩選驗(yàn)證，獲得體內(nèi)卡那霉素抗性體外鏈霉素抗性/卡那霉素敏感的突變株就是轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)上游含體內(nèi)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的突變株。利用這

3、種篩選策略共篩選到了5個(gè)含體內(nèi)誘導(dǎo)基因的突變株，對(duì)突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)序列的分析確定了4個(gè)霍亂弧菌感染成年小鼠過程中特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因。其中一個(gè)基因VC0303編碼一種紐氨酸激酶感受蛋白，這種蛋白分子通常與另外一種調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)菌許多重要的生理功能，另外確定的3個(gè)基因與氨基酸及核酸代謝相關(guān)，這類基因在以往的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)篩選中通常是占篩選到的體內(nèi)表達(dá)基因中最多的一部分，表明這類代謝相關(guān)基因在霍亂弧菌感染過程中發(fā)揮重要作用。我

4、們的研究結(jié)果表明，為了在小鼠體內(nèi)生存及增殖，霍亂弧菌必需調(diào)節(jié)與感受和代謝相關(guān)的基因。同時(shí)通過對(duì)編碼組氨酸激酶的VC0303基因的監(jiān)測(cè)表明，該基因在LB和霍亂毒素誘導(dǎo)培養(yǎng)基AKI中均不能被誘導(dǎo)表達(dá)。 為了鑒定霍亂弧菌在人造海水中生物膜形成相關(guān)基因，采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變法在聚苯乙烯96孔板中篩選了相關(guān)基因.總共獲得了10株生物膜增加突變株，對(duì)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的序列分析確定了9個(gè)生物膜相關(guān)基因。其中rfbU基因編碼一種甘露酰轉(zhuǎn)移酶，該基因

5、和其下游基因rfbV是形成霍亂弧菌O抗原所必需的。對(duì)rfbU突變株的生物膜形成情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該突變株在海水中能夠形成比野生型菌株更厚的生物膜，同時(shí)對(duì)該突變株在LB和海水中細(xì)菌脂多糖(LPS)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變株都不能產(chǎn)生LPS，表明LPS抑制霍亂弧菌海水中生物膜的形成。另外通過突變以及染色體上組成型表達(dá)另一個(gè)突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)下游磷酸戊糖途徑(PPP)相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，PPP途徑相關(guān)基因是霍亂弧菌海水中形成增厚生物膜所必需的。所有這些發(fā)