霍亂弧菌膽鹽外排相關基因篩選方法的建立及有氧生長相關蛋白Sco1和C-signal的研究.pdf

1、霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性腸道感染疾病，它是由革蘭氏陰性細菌霍亂弧菌所引起的。大量的研究表明，霍亂弧菌的致病能力主要是由霍亂毒素和毒素共調(diào)節(jié)菌毛引起的。
　　 膽鹽是膽汁的一部分，在人體內(nèi)能夠幫助消化脂肪。它也是一種去垢劑，能破壞細胞膜從而殺死細胞。霍亂弧菌能夠耐受一定濃度的膽鹽，說明它有某些基因能夠把膽鹽外排出細胞或是降解膽鹽。本實驗采用轉(zhuǎn)座子隨機插入基因組的方法篩選到一株對粗膽鹽、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉耐受能力顯著下降的霍亂

2、弧菌突變株，經(jīng)基因測序分析發(fā)現(xiàn)此基因與文獻報道的霍亂弧菌膽鹽外排泵一致。說明這種利用轉(zhuǎn)座子隨機插入失活來篩選膽鹽外排相關基因的方法的建立是可行的，可以通過此體系篩選其他可能存在的膽鹽外排相關基因。
　　 細胞色素c氧化酶是電子傳遞鏈終端氧化酶，它從細胞色素c得到電子，并把氧氣還原成水。銅離子遞呈基因sco1編碼的Sco1蛋白在酵母、枯草芽孢桿菌等微生物中起到了把銅離子傳遞給細胞色素c氧化酶的銅離子氧化還原中心的作用。在霍亂弧菌中

3、vca0038為假設的sco1基因。本實通過框內(nèi)敲除的方法獲得該基因的缺失突變株后，霍亂弧菌突變株在LB液體培養(yǎng)基和M9液體培養(yǎng)基中有氧條件下生長速度并未下降，細胞色素c氧化酶氧化能力和對過氧化氫的耐受能力也沒有下降。因此，推測該基因?qū)魜y弧菌的細胞色素c氧化酶氧化能力沒有影響。
　　 霍亂弧菌有三套群體感應系統(tǒng):CqsA/S系統(tǒng)、LuxS/PQ系統(tǒng)和VarS/VarA-CsrA/BCD系統(tǒng)。它們對霍亂弧菌的毒力基因表達等調(diào)控作

4、用。群體感應信號分子C-Signal在粘細菌Myxococcus xanthus有氧生長時細胞聚集并形成孢子的過程中起作用。這提示在霍亂弧菌中，假設的C-signal合成基因vc1815的產(chǎn)物對霍亂弧菌的群體感應系統(tǒng)可能有所影響。本實驗缺失該基因后，霍亂弧菌突變株的生物膜形成能力并未受明顯影響，其毒力共調(diào)節(jié)菌毛TCP的合成能力也未下降，在乳鼠腸道內(nèi)的定殖能力也未受到影響，推測該基因?qū)魜y弧菌群體感應系統(tǒng)可能沒有影響。
　　 本實

5、驗通過轉(zhuǎn)座子插入失活的方式構建了霍亂弧菌膽鹽外排相關基因的篩選方法，并驗證了該篩選方法是可行的。同時構建了霍亂弧菌與有氧生長相關的細胞色素c氧化酶基因vca0038和群體感應信號分子C-signal合成基因vc1815的框內(nèi)敲除突變株。發(fā)現(xiàn)vca0038缺失突變株的有氧生長以及細胞色素c氧化酶氧化能力未受明顯影響。而vc1815缺失突變株的生物膜形成等與群體感應相關的性狀與野生型相比也無明顯差別，推測這兩個基因可能不影響霍亂弧菌有氧生長