霍亂弧菌群體感應(yīng)調(diào)控因子VqmA活性相關(guān)基因的篩選及LysR和MFS蛋白功能的研究.pdf

1、霍亂弧菌（V.cholerae）是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧小桿菌，是引起人類腹瀉疾病霍亂的病原體。大量研究證明，霍亂弧菌的致病能力主要是由霍亂毒素（choleraetoxin，CT）和毒素共調(diào)節(jié)菌毛（toxin-coregulated pilus，TCP）引起的?；魜y弧菌毒力基因的表達(dá)受到各種環(huán)境條件的影響，如營(yíng)養(yǎng)物濃度和種類、溫度、pH、膽汁鹽和群體感應(yīng)信號(hào)分子。
　　 HapR是霍亂弧菌群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以抑

2、制霍亂弧菌CT和TCP表達(dá)。LuxR家族蛋白VqmA可以在低細(xì)胞濃度時(shí)誘導(dǎo)HapR的表達(dá)從而降低細(xì)菌的致病性。本文通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變文庫(kù)的方法篩選影響VqmA活性的基因，獲得七株候選的突變株，并且對(duì)突變株M1（△VC0073，SAM-依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶）做了深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)該基因缺失后，VqmA無(wú)法激活報(bào)告基因的表達(dá)，并且VqmA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性隨著該基因的回復(fù)表達(dá)而恢復(fù)，VC0073是VqmA發(fā)揮活性的必須基因。VC0073編碼合

3、成的蛋白與SAM-依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶的同源性最高，在很多細(xì)菌中該酶參與一些小分子化合物的合成，VqmA激活目的基因的過(guò)程可能需要該酶合成的某類化合物的協(xié)助，但是研究發(fā)現(xiàn)該化合物并不存在于細(xì)菌上清液中。
　　 LysR類蛋白是一種全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，霍亂弧菌中約有40個(gè)LysR類型的蛋白。借助生物信息學(xué)工具，在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)了五類比較特殊的LysR蛋白，這些蛋白的下游都為MFS家族蛋白。MFS家族蛋白屬于多重藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。我們選取

4、其中一組基因VC1617（Encoding LysR Protein）和VC1618（Encoding Multidrug Resistanceprotein）作為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)VC1617缺失和過(guò)表達(dá)后霍亂弧菌可以在LB和M9培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)，VC1617并不是細(xì)菌在這兩中培養(yǎng)基生長(zhǎng)的必需基因，這在一定程度上也反映出了LysR蛋白生理功能的多樣性。通過(guò)構(gòu)建Luminescence檢測(cè)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)LysR不但可以抑制自身的表達(dá)而且還可以激