霍亂弧菌中受毒力相關(guān)蛋白調(diào)控的過(guò)氧化物酶TagD抵御氧脅迫的機(jī)制及其生理功能的研究.pdf

1、霍亂是一種古老且流行廣泛的急性腸道感染烈性傳染病，其病原體是霍亂弧菌（Vibriocholerae）?；魜y的臨床特征是分泌性腹瀉，糞便為米泔樣，并伴有嘔吐。導(dǎo)致病人迅速脫水和體液電解質(zhì)缺乏，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致病人產(chǎn)生肌無(wú)力甚至休克死亡。霍亂弧菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短小，附著有單鞭毛和菌毛，其致病力主要由霍亂毒素和毒素共調(diào)節(jié)菌毛介導(dǎo)。
　　病原微生物在入侵和感染宿主時(shí)，宿主細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)抵御機(jī)制，產(chǎn)生大量ROS破壞病原微生物的膜脂、蛋白質(zhì)

2、、DNA及其它細(xì)胞組分，從而殺死病原微生物。而病原微生物會(huì)產(chǎn)生多種酶類(lèi)來(lái)抵御宿主細(xì)胞產(chǎn)生的ROS以保證感染效率，這些酶類(lèi)中有一類(lèi)為巰基過(guò)氧化物酶(Tpx)。該類(lèi)酶的大小約為20kDa，通常具有兩個(gè)決定蛋白質(zhì)功能的半胱氨酸殘基。對(duì)于Tpx的研究在大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、幽門(mén)螺旋桿菌等細(xì)菌中進(jìn)行得比較廣泛和深入，而在霍亂弧菌中的研究尚未有報(bào)道，并且表達(dá)該蛋白質(zhì)的基因tagD（vc0824）位于基因組中的流行性致病島內(nèi)，是受ToxR調(diào)控的下游基因

3、之一，因此本實(shí)驗(yàn)以霍亂弧菌巰基過(guò)氧化物酶TagD作為研究對(duì)象。
　　利用框內(nèi)敲除的方法構(gòu)建霍亂弧菌tagD突變株。發(fā)現(xiàn)在普通培養(yǎng)條件下，突變株與野生型菌株對(duì)氧脅迫的敏感性沒(méi)有差異;但在毒力基因誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)條件下，突變株與野生型菌株相比對(duì)氧脅迫更敏感。
　　在過(guò)氧化物酶中半胱氨酸殘基對(duì)其清除過(guò)氧化物的能力至關(guān)重要，因此構(gòu)建TagD蛋白的半胱氨酸殘基定點(diǎn)突變的菌株，檢測(cè)其在毒力基因誘導(dǎo)表達(dá)條件下對(duì)H2O2的敏感性。發(fā)現(xiàn)TagD

4、蛋白質(zhì)第59和93位Cys殘基點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸后，突變菌株對(duì)H2O2的敏感性與tagD缺失菌株相同，說(shuō)明了Cys59和Cys93殘基是決定TagD蛋白質(zhì)清除過(guò)氧化物能力的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。
　　在毒力誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中，tagD突變株表現(xiàn)出了對(duì)氧脅迫的敏感性，且有報(bào)道tagD受ToxR的調(diào)節(jié)，同時(shí)在霍亂弧菌中ToxR還調(diào)節(jié)ToxT。通過(guò)構(gòu)建Luminescence報(bào)告基因菌株以及DNaseⅠFootprint實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)tagD也受到To

5、xT的調(diào)節(jié)，并且ToxT的表達(dá)對(duì)霍亂弧菌抗氧脅迫的能力也有一定的影響，揭示了ToxR通過(guò)下游調(diào)控蛋白ToxT實(shí)現(xiàn)對(duì)tagD的調(diào)控。
　　進(jìn)一步的細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TagD蛋白自身可以形成同型二聚體，但在氧脅迫條件下，該蛋白二聚體化的能力明顯減弱，說(shuō)明TagD蛋白在其清除過(guò)氧化物過(guò)程中單體是其主要的活性形式。在乳鼠小腸定殖實(shí)驗(yàn)中，tagD缺失菌株與野生型菌株的定殖能力沒(méi)有顯著差異;但在氧脅迫較高的斑馬魚(yú)的腸道定殖實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)接種條件