山東省霍亂弧菌的時空分布及變化.pdf

1、[研究背景]
　　霍亂(Cholera)是一古老的急性腸道傳染病，全球發(fā)生的七次霍亂大流行都嚴(yán)重危害著人們的生命和健康，特別是對于發(fā)展中國家而言更是重大的公共衛(wèi)生問題。霍亂的病原體霍亂弧菌（Vibrio cholerae，V.cholerae）是一革蘭氏陰性弧菌，可分為200多個血清型，其中O1群和O139群是兩種最為重要的能引起嚴(yán)重臨床癥狀且能引起霍亂暴發(fā)流行的血清型，O1群主要包括小川型(Ogawa)和稻葉型(Inaba)兩種

2、血清型以及古典型(Classical biotype)和E1Tor型(El Tor biotype)兩種生物型。
　　在全球前六次的霍亂大流行中，病原體主要是O1群古典型霍亂弧菌，而自1961年起第七次霍亂流行中，O1群E1Tor型取代了古典型成為優(yōu)勢菌型，并與1964年傳入中國廣東，同年在山東檢出，此后波及全省各地區(qū)。1992年，O139群霍亂弧菌作為新的血清型在印度出現(xiàn)并迅速向鄰國引起暴發(fā)疫情，第二年在中國新疆出現(xiàn)了O13群霍

3、亂病例，進而于1997年在煙臺萊陽檢出山東省首株O139群霍亂弧菌。自1964年以來，霍亂疫情在山東省一直沒有間斷，經(jīng)歷了多次暴發(fā)流行且累及各個地區(qū)，血清型也經(jīng)過了O1群小川型、O1群稻葉型和O139群多次變化。
　　由于歷史原因，1964～1975年期間霍亂疫情報告工作不完善，有關(guān)的霍亂疫情報告及記錄均為空白。本研究對山東省自1976年至今霍亂疫情流行病學(xué)特征及不同時間和地區(qū)代表菌株的毒力基因、脈沖場凝膠電泳(Pulsed Fi

4、eld Gel Electrophoresis，PFGE)基因分型等分子流行病學(xué)研究能夠細(xì)致的分析霍亂在局部地區(qū)的流行特征時空變異規(guī)律，對霍亂疫情的防控有著更加現(xiàn)實的指導(dǎo)意義，同時山東霍亂的流行特征也能反映全國乃至全球的態(tài)勢，對大范圍的研究有著補充作用。
　　[研究目的]
　　1、系統(tǒng)分析山東省霍亂疫情的時間、地區(qū)、人群等三間分布流行病學(xué)特征;
　　2、細(xì)致了解山東省霍亂弧菌血清型、毒力基因及PFGE基因分型的時空分布

5、及變化規(guī)律，同時探討三者之間的關(guān)系;
　　3、初步建立山東省霍亂弧菌的PFGE基因分型數(shù)據(jù)庫，便于以后霍亂疫情的溯源及比對分析。
　　[研究方法]
　　1、流行病學(xué)資料整理:對山東省自1976年以來登記的所有霍亂疫情菌株血清型、分離時間、分離地點、病人臨床資料、流行強度等流行病學(xué)資料進行整理。
　　2、菌株選擇及復(fù)核:根據(jù)流行病資料選取時間和空間兩個維度的代表菌株，按照以暴發(fā)為主、兼顧散發(fā)的原則選取代表菌株，同時

6、增菌分離培養(yǎng)及血清凝集和生化鑒定。
　　3、脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型:按照Pulse Net霍亂弧菌PFGE分型的標(biāo)準(zhǔn)方案進行操作，細(xì)菌裂解時間為1h，Not酶切時間為4h，電泳條件Block1初始和最終轉(zhuǎn)換時間為2s和10s，電泳時間為13h，Block2中時間分別為20s、25s和6h。
　　4、毒力基因檢測:提取代表菌株核酸，PCR檢測ctxAB、tcpA、tcpI、toxR、rtxA和hlyA等6種毒力基因。<

7、br>　　5、數(shù)據(jù)分析:利用SAS9.1軟件對山東省霍亂弧菌血清型毒力基因的分布差異等分類數(shù)據(jù)進行卡方檢驗;利用Bionumerics 6.0軟件對代表菌株的PFGE條帶進行聚類分析，結(jié)合流行病學(xué)資料分析時空變化規(guī)律。
　　[結(jié)果]
　　1、流行病學(xué)特征:
　　(1)自1976年以來，山東省各地區(qū)均有霍亂疫情出現(xiàn)，其中魯西南和魯北地區(qū)最為嚴(yán)重，魯中地區(qū)患者相對較少;
　　(2)自1976年以來，山東省霍亂病例幾乎

8、每年均有出現(xiàn)，其中在1983年～1984年和1994年出現(xiàn)了兩個流行高峰;
　　(3)從1976年至今山東省霍亂疫情分離菌株依次經(jīng)歷了小川型、稻葉型、和O139群的更替變遷過程;
　　(4)小川型霍亂弧菌疫情主要集中在魯北地區(qū)，而稻葉型霍亂弧菌則主要集中在魯西南地區(qū);
　　(5)O1群霍亂疫情患者年齡分布較為均勻，而O139群霍亂患者多為老年人。
　　2、毒力基因分布:
　　(1)毒力基因hlyA和toxR

9、，rtxA在環(huán)境株和臨床分離株陽性率均接近100％，而臨床分離株ctxAB、tcpI和tcpA三種毒力基因的陽性率則遠(yuǎn)高于環(huán)境分離株;
　　(2)臨床分離株ctxAB、tcpI和tcpA三種毒力基因的陽性率有隨時間上升的趨勢，但2000年之后優(yōu)勢菌群O139群霍亂弧菌毒力基因的攜帶率有所降低;
　　(3)毒力基因tcpI和tcpA表達(dá)較為一致，且在暴發(fā)疫情分離株的陽性率高于散發(fā)疫情菌株，而ctxAB沒有明顯差異。
　　

10、3、PFGE基因分型:
　　(1)250株代表菌株整體上主要聚為PⅠ、PⅡ、PⅢ和PⅣ4類，前3類和血清血型相吻合，依次為臨床分離株O1群稻葉型、O139群和O1群小川型，而PⅣ主要為毒力基因缺失的菌株，來源及血清型較為混雜;
　　(2)PⅠ可進一步聚類為PⅠa和PⅠb亞類，其中PⅠa主要為1980年～1983年魯西南地區(qū)菌株，PⅠb主要為2001年魯中和魯北地區(qū)菌株;PⅡ可分為PⅡa和PⅡb亞類，PⅡa為2009年之前的O

11、139群菌株，PⅡb為2013年濟寧霍亂疫情菌株;PⅢ可分為PⅢa、PⅢb和PⅢc亞類，其中PⅢa為1998年～1999年分散全省的菌株形成的亞類，PⅢb為1986年～1997年主要分布于魯東和魯北地區(qū)菌株形成的亞類，PⅢc主要是1978年濟寧和日照分離菌株;PⅣ類的菌株來源較為混亂，但毒力基因缺失為其共同特征;
　　(3)250株霍亂弧菌形成了179個PFGE型，在每個亞類中均存在多菌株形成的同一PFGE型別，這主要見于三種情況

12、:
　?、賮碜酝换魜y暴發(fā)疫情;
　?、诓煌瑫r間相同地域的霍亂疫情;
　?、弁粫r間相近地域的霍亂疫情。
　　[結(jié)論]
　　1、在第七次全球霍亂大流行中，山東省霍亂疫情持續(xù)存在了半個世紀(jì)，流行強度發(fā)生著變化，不同年份和地區(qū)的優(yōu)勢血清型出現(xiàn)多次更替;
　　2、山東省臨床分離的霍亂弧菌多為產(chǎn)毒株，且毒力基因ctxAB、tcpI和tcpA的陽性率存在時間和地區(qū)差異。而毒力基因缺失的臨床分離株，可能與hlyA