中國0139群霍亂弧菌藥物敏感性分析和耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的:抗生素的廣泛使用甚至濫用使得細(xì)菌面臨異常的選擇壓力，而這種選擇壓力促使細(xì)菌通過各種機(jī)制獲得耐藥性，如基因突變和耐藥基因的水平傳遞，從而使細(xì)菌對各類抗生素均可產(chǎn)生耐藥，尤其最近關(guān)于細(xì)菌多重耐藥的報(bào)道越來越多。0139群霍亂弧菌是霍亂中的新病原體，1992年出現(xiàn)以來，在東南亞以及我國引起流行，并常導(dǎo)致聚餐暴發(fā)。為了解我國0139群霍亂弧菌的耐藥性狀況，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供依據(jù)，本研究對我國0139群霍亂弧菌出現(xiàn)流行以來的分離株選擇3

2、00株進(jìn)行了藥物敏感性檢測，以了解我國0139群霍亂弧菌的耐藥狀況和耐藥譜變化，并進(jìn)一步從耐藥基因水平傳遞和基因突變兩個(gè)方面對耐藥機(jī)制進(jìn)行研究。 方法:根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI標(biāo)準(zhǔn)中建議臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對霍亂弧菌和腸桿菌科常規(guī)藥敏試驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮的抗生素，選取各類藥物中有代表性的17種抗生素，采用WHO推薦的瓊脂稀釋法和微量肉湯稀釋法，對我國1993年-2007年間分離到的0139群霍亂弧菌選擇300株進(jìn)行藥物敏感性

3、試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為ATCC25922和ATCC29213。通過GenBank搜索1-4類整合子和SXT接合性轉(zhuǎn)移元件的基因序列，分別在各自特異性整合酶保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增檢測相應(yīng)水平傳遞和耐藥基因在霍亂弧菌中的分布情況，評價(jià)其在細(xì)菌耐藥性方面發(fā)揮的作用。通過GenBank搜索霍亂弧菌拓?fù)洚悩?gòu)酶編碼基因gyrA、gyrB、parC和parE序列，在喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)決定區(qū)設(shè)計(jì)引物，對215株萘叮酸耐藥菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增后序列測定

4、，分析耐藥菌株在這些基因變中的序列突變特征。 結(jié)果:300株0139群霍亂弧菌對三代頭孢曲松和頭孢克肟均敏感，敏感率達(dá)到100％，對頭孢呋辛、頭孢噻吩、強(qiáng)力霉素和環(huán)丙沙星也大部分敏感，敏感率分別為99．3％、83．3％、91．3％和95．0％，對阿奇霉素、呋喃托因的敏感率分別為65．3％、53．3％，而超過半數(shù)的霍亂弧菌對氯霉素、卡那霉素、萘啶酸、四環(huán)素、氨芐西林和復(fù)方新諾明耐藥，敏感率分別只有39．0％、31．0％、27．3％

5、、27．0％、25．3％和17．0％，大部分0139群霍亂弧菌對鏈霉素、紅霉素和多粘菌素B耐藥或者中度耐藥，敏感率分別只有1．0％、6．0％和3．3％。99．0％的0139群霍亂弧菌對2種以上的抗生素耐藥，47．0％的菌株表現(xiàn)出相同多重耐藥譜，即對氨芐西林、復(fù)方新諾明、鏈霉素、氯霉素、萘啶酸、四環(huán)素、紅霉素和卡那霉素這8種抗生素耐藥。0139群霍亂弧菌對氨芐西林、萘啶酸、四環(huán)素、氯霉素和卡那霉素的耐藥性隨年代逐漸升高，并在1998后穩(wěn)定

6、于較高水平。產(chǎn)CT毒素組霍亂弧菌對萘啶酸、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素等8種抗生素的耐藥率明顯高于非產(chǎn)毒組。 整合子檢測結(jié)果顯示，64．3％的0139群霍亂弧菌中存在1類整合子，這些菌株中沒有未發(fā)現(xiàn)2類和3類整合子，100％的菌株存在4類整合子?；魜y弧菌1類整合子陽性菌株中90．6％的可變區(qū)只有一個(gè)耐藥基因，插入基因盒以aadA（氨基糖苷類耐藥相關(guān)）基因家族為主，7．8％菌株的可變區(qū)含dfrA12（甲氧芐氨嘧啶

7、耐藥相關(guān)）、orfF（功能未知）和aadA2共3個(gè)基因，另外還有2株菌含2個(gè)耐藥基因arr-2（利福平耐藥相關(guān)）和aadA3C，1株菌含3個(gè)耐藥基因arr-3，dfrA27和aadA16。 215株萘啶酸耐藥菌株拓?fù)洚悩?gòu)酶耐藥決定區(qū)測序結(jié)果顯示：95．3％的菌株都存在兩個(gè)位點(diǎn)突變，即gyr第248位堿基突變導(dǎo)致第83位氨基酸由絲氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔琾ar第254位堿基點(diǎn)突變導(dǎo)致第85位氨基酸由絲氨酸Ser變?yōu)榱涟彼帷?株環(huán)丙沙星耐

8、藥菌株中6株分離于2001年，在1998年和2006年各分離一株，除上述兩個(gè)位點(diǎn)突變外，GyrA第87位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)樘於０?，另外其?株菌ParE第420位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)樘於０罚€有1株環(huán)丙沙星耐藥菌ParE第439位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸。 結(jié)論:0139群霍亂弧菌對抗生素的耐藥性呈上升趨勢，并在1998年后形成對氨芐西林、復(fù)方新諾明、鏈霉素、氯霉素、萘啶酸、四環(huán)素、紅霉素和卡那霉素8種抗生素耐藥的優(yōu)勢多重

9、耐藥譜，目前推薦使用的第二代喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星耐藥率低，但已經(jīng)開始出現(xiàn)耐藥株。1、4類整合子和SXT在0139霍亂弧菌中分布廣泛，這三種基因元件均具有獲得外源性耐藥基因的能力，在細(xì)菌耐藥性方面發(fā)揮重要作用。0139群霍亂弧菌中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ及Ⅳ編碼基因gyrA和parC突變較普遍，多為點(diǎn)突變，gyrB和parE突變較少，大部分菌株都存在GyrA第83位和ParC第85位氨基酸取代，GyrA第87位氨基酸替換對喹諾酮類耐藥性具有重要作用，