三種外源代謝物對(duì)提高耐藥副溶血性弧菌藥物敏感性的機(jī)理研究.pdf

1、我國(guó)是抗菌藥物的生產(chǎn)和使用大國(guó)。抗菌藥物廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域，在治療感染性疾病挽救患者生命、防治動(dòng)物疫病提高養(yǎng)殖效益以及保障公共衛(wèi)生安全中，發(fā)揮了重要作用。但是，由于新型抗菌藥物研發(fā)能力不足、藥店無(wú)處方銷(xiāo)售抗菌藥物、醫(yī)療和養(yǎng)殖領(lǐng)域不合理應(yīng)用抗菌藥物、制藥企業(yè)廢棄物排放不達(dá)標(biāo)、群眾合理用藥意識(shí)不高等多種因素，細(xì)菌耐藥問(wèn)題日益突出。
　　副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌?；【筛腥镜乃拗鞣秶鷺O廣包括魚(yú)和甲殼類(lèi)在內(nèi)的經(jīng)濟(jì)水

2、產(chǎn)動(dòng)物，同時(shí)也是引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，是我國(guó)沿海地區(qū)食源性疾病的主要病原菌。目前，使用抗菌藥物仍然是控制和治療弧菌病的主要手段，抗生素的過(guò)度使用也導(dǎo)致了副溶血性弧菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。近年來(lái)，有研究表明外源添加小分子代謝物可以增強(qiáng)耐藥遲鈍愛(ài)德華氏菌對(duì)氨基糖類(lèi)抗生素的敏感性。(1)本研究近一步比較了三種外源物質(zhì)（葡萄糖、丙氨酸、甘油）對(duì)增強(qiáng)副溶血性弧菌抗生素敏感性的作用效果，并采用電子傳遞鏈抑制劑CCCP對(duì)表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證

3、。(2)基于定量蛋白質(zhì)組學(xué) ITRAQ技術(shù)，深入研究細(xì)胞代謝微環(huán)境與菌體藥物敏感性變化機(jī)制，為后續(xù)復(fù)合型抗生素試劑的開(kāi)發(fā)奠定理論研究基礎(chǔ)。(3)在基因水平上對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中感興趣的差異蛋白表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)數(shù)據(jù)分析初步表明外源代謝物可通過(guò)底物激活，加強(qiáng)菌體細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化水平，顯著提高了質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力(Proton motive force，PMF)以及跨膜初級(jí)鈉泵離子通道草酰乙酸脫羧酶（Oxaloacetate decarboxylase

4、）含量共同促進(jìn)胞外氨基糖苷類(lèi)抗生素跨膜運(yùn)輸，從而有效提高了耐藥副溶血性弧菌細(xì)胞內(nèi)氨基糖苷類(lèi)抗生素的有效濃度，提高了細(xì)菌對(duì)亞抑菌濃度抗生素的敏感性，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　1.三種外源代謝物對(duì)增強(qiáng)副溶血性弧菌抗生素敏感性作用效果的比較
　　本實(shí)驗(yàn)在基于耐藥代謝狀態(tài)以及利用原有抗生素來(lái)防治多重耐藥細(xì)菌研究成果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究比較了在亞抑菌濃度卡那霉素脅迫條件下，外源添加糖、脂、氨基酸對(duì)增強(qiáng)副溶血性弧菌藥物敏感性作用效果

5、的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，耐藥弧菌在分別添加終濃度為10 mM葡萄糖、丙氨酸、甘油后于37℃培養(yǎng)6h，其對(duì)1/8MIC卡那霉素藥物敏感性分別提高了27000倍，3228倍，102倍。其中以葡萄糖為代表糖代謝途徑對(duì)提高耐藥細(xì)菌恢復(fù)作用效果較為顯著，氨基酸代謝次之，脂質(zhì)代謝則對(duì)能量代謝通路調(diào)控能力較弱。并通過(guò)偶聯(lián)劑CCCP對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。CCCP消除了由外源代謝物代謝所產(chǎn)生的質(zhì)子跨膜梯度，導(dǎo)致外源代謝物的添加失去作用。通過(guò)表型實(shí)驗(yàn)初步

6、表明外源代謝物可通過(guò)促進(jìn)氧化磷酸化及跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)產(chǎn)生，刺激了菌體對(duì)胞外氨基糖苷類(lèi)抗生素的吸收。后續(xù)進(jìn)一步的作用機(jī)制將在蛋白網(wǎng)絡(luò)水平上對(duì)細(xì)菌細(xì)胞代謝狀態(tài)水平的變化進(jìn)行深入闡釋和驗(yàn)證。
　　2.基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)ITRAQ闡釋外源代謝物對(duì)增強(qiáng)副溶血性弧菌抗生素敏感性作用機(jī)理研究
　　本次實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入分析了三種外源代謝物對(duì)提高副溶血性弧菌藥物敏感性的作用機(jī)制。ITRAQ共鑒定出了178個(gè)差異蛋白。其中顯著表

7、達(dá)上調(diào)蛋白質(zhì)（P＜0.05, ratio＞1.5）71個(gè)，顯著表達(dá)下調(diào)蛋白質(zhì)（P＜0.05, ratio＜0.75）107個(gè)。顯著的差異代謝通路主要集中在細(xì)菌的能量代謝通路、跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體和陽(yáng)離子通道、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等相關(guān)生物過(guò)程。其中糖代謝通路上丙酮酸脫氫酶PDH、檸檬酸合酶 GltA、酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體-亞基 OGD、琥珀酰輔酶合成酶β亞基SucC、琥珀酸脫氫酶SDH表達(dá)量均有明顯提高。氨基酸代謝通路富集到的差

8、異主要集中在天冬氨酸-精氨酸合成代謝、甘氨酸和丙氨酸等代謝通路。已知氨基酸代謝在調(diào)控胞內(nèi) pH,產(chǎn)生代謝能量或還原力以及調(diào)節(jié)胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有重要作用，而無(wú)氧呼吸過(guò)程相關(guān)的乳糖代謝通路中關(guān)鍵酶乳糖脫氫酶和細(xì)胞分裂因子則受到顯著抑制。其中有趣的是草酰乙酸脫羧酶作為主要的初級(jí)Na+泵離子通道其含量發(fā)生顯著的變化。草酰乙酸脫羧酶（Oxaloacetate decarboxylase，Oad）是一個(gè)多酶復(fù)合體，由α亞基（OadA,63-65K

9、Da）,β亞基（OadB,40-45Kda），γ亞基（OadG,9-10KDa）組成，該多酶復(fù)合體三個(gè)亞基蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)，從差異蛋白交互作用分析得出草酰乙酸脫氫酶作為嗜鹽菌中重要的陽(yáng)離子跨膜通道（嗜鹽菌中重要的物質(zhì)運(yùn)輸交換通道之一），其活性亞基 OadG與糖酵解中關(guān)鍵限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶pckA互作關(guān)聯(lián)緊密，與天冬氨酸與精氨酸合成代謝以及引發(fā)SOS易錯(cuò)修復(fù)阻遏蛋白lexA和主要的DNA修復(fù)酶—DNA聚合酶IV dinB存在

10、顯著的互作關(guān)系，該酶氧化脫酸產(chǎn)物α-酮戊二酸可進(jìn)入菌體主要能量代謝通路檸檬酸循環(huán)，水解產(chǎn)生的能量可促使胞內(nèi)Na+外排產(chǎn)生的陽(yáng)離子動(dòng)力勢(shì)促進(jìn)胞外溶質(zhì)的吸收。從通路富集結(jié)果猜測(cè)嗜鹽類(lèi)海洋弧菌可通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)并偶聯(lián)草酰乙酸多酶復(fù)合體組成的初級(jí)鈉泵離子通道促進(jìn)胞外氨基糖苷類(lèi)抗生素的跨膜運(yùn)輸，有效提高了胞內(nèi)抗生素的有效濃度。為殺死多藥耐藥副溶血性弧菌提供了新思路，也為復(fù)合型抗生素新藥開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。
　　3.基因水平上對(duì)