霍亂弧菌HutX蛋白的提取和血紅素結(jié)合能力研究.pdf

1、鐵元素的獲取對于霍亂弧菌的生存和繁殖起著至關(guān)重要的作用。雖然自然界鐵元素的含量豐富，但是由于鐵的不穩(wěn)定性，在富含水和氧氣的外界環(huán)境中容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，其產(chǎn)物難以被微生物利用;在人體中，大量的鐵以結(jié)合鐵蛋白的形式存在，游離的二價鐵離子含量極少，難以滿足霍亂弧菌的生存要求，因此霍亂弧菌必須奪取血紅素中的鐵元素來滿足自身生存和繁殖的需要。
　　 目前，人們已經(jīng)對霍亂弧菌獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)血紅素的機(jī)制十分了解。大量研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌自身可以釋

2、放具有高親和力的小分子蛋白——載鐵素，載鐵素能夠高效的結(jié)合宿主體內(nèi)的血紅素，并通過TonB系統(tǒng)帶回到細(xì)胞周質(zhì)，再由PBP將鐵元素轉(zhuǎn)給ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，ABC系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞體。然而，由于血紅素不能直接被霍亂弧菌利用，且大量聚集的血紅素對細(xì)胞膜有破壞作用，所以進(jìn)入細(xì)胞的血紅素仍需要經(jīng)過復(fù)雜的生化反應(yīng)降解血紅素并獲取其中的鐵元素。但是對于血紅素進(jìn)入胞體之后的命運(yùn)研究者卻知之甚少。
　　 有研究認(rèn)為霍亂弧菌的HutZ蛋白可能參與了血紅素的

3、胞內(nèi)降解反應(yīng)，具有降解酶或者暫時儲存血紅素的作用。因此我們猜測與HutZ蛋白共用一個啟動子，同時表達(dá)的HutX蛋白也可能參與了這一反應(yīng)過程。HutX蛋白屬于HutX-ChuX超蛋白家族，具有保守結(jié)構(gòu)域DUF1008，該家族的其他蛋白均被證明具有血紅素結(jié)合能力，如HemS蛋白具有血紅素降解酶的功能，與HutX蛋白同源性最高的ChuX蛋白近期也被證明可以與血紅素結(jié)合。先前研究認(rèn)為ChuX在大腸桿菌的鐵元素利用過程中起到短時間儲存血紅素的作用

4、，以防止?jié)撛诳赡艿难t素毒性促進(jìn)非氧化還原反應(yīng)破壞細(xì)胞膜。因此，我們認(rèn)為HutX具有潛在的血紅素結(jié)合能力，并參與了血紅素胞內(nèi)利用的反應(yīng)過程。
　　 目的:
　　 驗(yàn)證霍亂弧菌HutX蛋白是否具有血紅素結(jié)合能力，并分析與血紅素結(jié)合能力相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)，以此推測HutX蛋白在霍亂弧菌鐵元素?cái)z取及利用過程中的作用。
　　 方法:
　　 為了證實(shí)我們的推測，我們采用霍亂弧菌01 biovar EI Tor str.

5、N16961的基因組為模板翻譯表達(dá)出HutX蛋白，通過鎳柱親和層析、SourceQ陰離子交換柱層析和Superdex200分子篩柱層析等純化所得蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行驗(yàn)證，獲取純化的HutX蛋白與血紅素按照一定的比例充分混合后，進(jìn)行分光光度測量，并對光譜進(jìn)行分析;在驗(yàn)證HutX蛋白具有血紅素結(jié)合能力后，為了進(jìn)一步分析HutX蛋白與血紅素結(jié)合的氨基酸殘基以及結(jié)合方式，我們通過對已知同源蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，推測HutX蛋白與血紅素的結(jié)合

6、位點(diǎn)，在驗(yàn)證過程中，我們對潛在結(jié)合位點(diǎn)突變后純化獲取突變的HutX蛋白，與血紅素按相同比例結(jié)合后進(jìn)行分光光度測量，并與野生型HutX-血紅素復(fù)合物的光譜進(jìn)行對照。
　　 結(jié)果:
　　 通過驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)我們獲取的蛋白為純化的HutX蛋白，野生型HutX蛋白-血紅素復(fù)合物所得光譜證明HutX蛋白與血紅素形成的復(fù)合物所得光譜中存在一大一小兩個波峰，對比已知物質(zhì)的光譜結(jié)果以及同源類似物的光譜結(jié)果，可以得知HutX蛋白與血紅素以六

7、配位鍵的形式結(jié)合，該結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，不易于其他物質(zhì)發(fā)生變化，但是HutX蛋白-血紅素復(fù)合物的小波峰較典型的六配位鍵物質(zhì)光譜結(jié)果中的小波峰小，而趨向于五配位鍵的結(jié)合形式，所以我們認(rèn)為HutX蛋白與血紅素應(yīng)該以五配位鍵、六配位鍵混合的方式與血紅素結(jié)合，在溶液中兩種結(jié)合方式達(dá)到平衡，與ChuX蛋白的結(jié)合方式相似。我們進(jìn)一步通過對HutX蛋白的同源蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)在HutX蛋白的同源類似物中均存在一個保守的結(jié)構(gòu)域，先前對HemS和ChuX蛋

8、白的結(jié)構(gòu)和功能研究已經(jīng)證明該結(jié)構(gòu)中存在血紅素結(jié)合位點(diǎn)，且該位點(diǎn)為保守的氨基酸序列，通過氨基酸序列比對，我們推測得到兩個潛在的HutX蛋白與血紅素的結(jié)合位點(diǎn)，H103和F119，紫外-可見光譜結(jié)果顯示對兩個位點(diǎn)分別進(jìn)行突變后大小兩個波峰均消失，僅在波長值約為200nm處獲得一個單一的波峰，有可能為HutX二聚體蛋白波峰。因此可以認(rèn)為突變的HutX蛋白失去血紅素結(jié)合能力，說明H103和F119均是HutX蛋白結(jié)合血紅素的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　

9、　 結(jié)論:
　　 該實(shí)驗(yàn)證明了HutX蛋白具有血紅素結(jié)合能力，但是HutX-血紅素復(fù)合物不穩(wěn)定，與其結(jié)合的鐵元素處于活躍狀態(tài)，容易與其他化合物發(fā)生反應(yīng)。因此我們認(rèn)為HutX蛋白可能具有短暫儲存血紅素以減少細(xì)胞內(nèi)血紅素水平。在霍亂弧菌獲取到大量血紅素的時候，HutX蛋白結(jié)合血紅素，以保證積累的血紅素毒性不會破壞霍亂弧菌的細(xì)胞膜而導(dǎo)致細(xì)胞死亡;同時，由于HutX蛋白與血紅素結(jié)合不緊密，所以其他蛋白可以很容易的從HutX蛋白和血紅素

10、的復(fù)合物中獲取血紅素，提取其中二價鐵離子加以利用。因此，HutX蛋白以五配位鍵、六配位鍵方式與血紅素的結(jié)合即有利于對細(xì)胞膜的保護(hù)，也有利于對血紅素及二價鐵離子的利用。先前對ChuX蛋白的研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的ChuX蛋白具有與HutX蛋白類似的功能，考慮到來兩個蛋白在氨基酸序列以及結(jié)構(gòu)上的高度相似性，該研究支持了我們的結(jié)論。我們的研究證明HutX蛋白的血紅素結(jié)合能力和結(jié)合位點(diǎn)，并依據(jù)此對HutX蛋白的功能進(jìn)行了推測和討論，為進(jìn)一步研究該蛋白