血紅蛋白及血紅素結構的光譜和電化學研究.pdf

1、以血紅素為活性中心的氧化還原蛋白酶直接電化學的研究是目前生物電化學研究的熱點,比如血紅蛋白(Hb)、肌紅蛋白(Mb)、辣根過氧化物酶(HRP)、過氧化氫酶(CAT)、細胞色素c(Cty c)等蛋白酶在電化學方面的研究報道有很多。通過研究血紅素蛋白酶與電極間的電子傳遞過程,可以了解生物體內電子傳遞機理和生理作用機理,也為第三代蛋白酶生物傳感器的研發(fā)提供了理論基礎。人工模擬生物體內蛋白酶的方法技術對解決天然蛋白酶的局限性以及代替天然蛋白酶用

2、于生物學和化學分析等都很重要的意義。
　　本實驗采用高分子納米復合功能化材料將血紅蛋白固定在玻碳電極上,通過循環(huán)伏安法研究了血紅蛋白的直接電化學特性,采用線性掃描和時間電流測試了修飾電極對過氧化氫(H2O2)的催化響應。結果表明:血紅蛋白受電極表面控制影響,血紅蛋白被成功固定在電極表面并能進行有效地直接電子轉移,血紅蛋白與電極之間氧化還原反應為單電子傳遞過程,電子傳遞率ks為4.2±0.2 s-1;通過電流時間法測試出該電極能保持

3、對H2O2還原的生物催化活性對 H2O2有響應,其檢測范圍為0.05~1 nM,最低檢測限為0.05(±0.01 nM)。測得血紅蛋白的表觀米氏常數Kmapp為0.85(±0.1) nM。實現了對H2O2高靈敏度低檢測限的檢測,為研制出第三代痕量H2O2生物傳感器奠定了基礎。
　　本實驗采用半合成酶制備的原理,用內部疏水的SDS結構模擬酶的外部結構,用小分子的血紅素和組氨酸模擬酶的內部催化活性結構,通過自組裝的方式以天然辣根過氧化

4、物酶(HRP)為特征構建了人工過氧化物酶,模擬其催化活性并應用于生物電化學的研究。
　　首先,本工作采用光譜學法對由50 mM SDS納米膠團和10μM血紅素(heme)-50 mM組氨酸(His)溶液自組裝構建的人工過氧化物酶的催化能力、結構、酶動力學、自殺性失活進行了研究。結果表明:采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定人工過氧化物酶、heme及天然HRP的表觀催化活性,觀察到了人工過氧化物酶具有良好的催化過氧化氫及愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化反應的活性

5、,且人工過氧化物酶在pH8.0時表現出較高的表觀活性;在臨界膠團濃度(CMC)以上,SDS膠團的濃度對人工過氧化物酶的活性幾乎沒有影響,組氨酸濃度對人工過氧化物酶的活性有一定影響,在一定濃度范圍內會隨著His濃度增加而增加;測試得到其具有可觀的催化效率,其中酶動力學參數Km值為5.5μM,催化速率常數為0.06s-1,人工過氧化物酶催化效率為0.011μM-1s-1,相當于天然HRP催化效率的15％。本文還測試了人工過氧化物酶在高濃度

6、H2O2下的穩(wěn)定性,數據顯示人工過氧化物酶會隨著H2O2濃度的增加反應速度增加,在酸性環(huán)境中,人工過氧化物酶對高濃度H2O2抵抗能力強,但反應速度比較慢;而人工過氧化物酶在堿性環(huán)境中,抵抗底物自殺性失活能力比較弱,但酶反應速度最快,說明低pH溶液有助于結構穩(wěn)定,高pH溶液有利于活性的提高。
　　再者,采用電化學分析法對人工過氧化物酶的電化學特性進行了研究。本實驗將人工過氧化物酶固定在高分子納米復合材料修飾的玻碳電極上。通過循環(huán)伏安