影響霍亂弧菌在宿主體內(nèi)定殖的生理調(diào)控因素的相關研究.pdf

1、霍亂弧菌是一種可以引起霍亂傳染病的病原細菌，人類感染后可導致急性腹瀉、脫水甚至死亡。自18世紀以來，在世界范圍內(nèi)爆發(fā)了多次霍亂大流行，至今還在威脅人類的健康。霍亂弧菌被人攝入后通過口腔經(jīng)胃液進入小腸內(nèi)，穿過粘液層后開始定殖。一旦進入小腸后，霍亂弧菌的毒力基因被宿主體內(nèi)條件誘導表達，其中毒力共調(diào)節(jié)菌毛(TCP)與霍亂毒素(CT)是導致霍亂弧菌產(chǎn)生毒力的重要致病因子。
　　霍亂弧菌在人體內(nèi)定殖是一個有序且復雜的過程，需要特殊的環(huán)境因子

2、以及多個自身基因的調(diào)控和參與。宿主體內(nèi)對于霍亂弧菌是一個多樣性的環(huán)境，一方面宿主體內(nèi)因子如膽鹽、低氧濃度等激活毒力系統(tǒng)表達;另一方面，宿主體內(nèi)環(huán)境對病原細菌生存也是一種逆境。細菌不僅要面對抗菌物質(zhì)的攻擊，還要與其他腸道土著細菌發(fā)生競爭性定殖等。在細菌的定殖過程中，已知的影響細菌定殖的因素包括毒力共調(diào)節(jié)菌毛、生物膜、毒素/抗毒素系統(tǒng)、抗氧化脅迫等。
　　霍亂弧菌內(nèi)存在至少13套毒素/抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin sys

3、tems，TA)系統(tǒng)，被認為可以發(fā)揮穩(wěn)定遺傳超級整合子的作用。目前這些系統(tǒng)在致病能力、生物膜形成、耐藥機制中發(fā)揮的功能尚不清楚。本文以霍亂弧菌中的13組TA系統(tǒng)為研究對象，首先對RelBE家族中7組進行了毒素功能鑒定，有6組可以編碼毒素蛋白，對細菌生長產(chǎn)生抑制。隨后對這13組TA系統(tǒng)的缺失株在乳鼠腸道競爭定殖能力、生物膜形成、耐藥性以及對宿主環(huán)境因子的敏感性等方面進行了檢測。發(fā)現(xiàn)其中4組TA系統(tǒng)參與霍亂弧菌的定殖過程，RelBE-4和R

4、elBE-7缺失株在乳鼠體內(nèi)的競爭定殖能力低于野生株，而ParDE-2和ParDE-3缺失株在競爭定殖能力中要高于野生株。TcpA的表達水平在缺失株與野生株中相比并沒有明顯差異，說明這4組毒素/抗毒素系統(tǒng)可能通過其他途徑影響細菌的定殖能力。隨后對細菌抗逆境相關表型進行了檢測，以探究TA系統(tǒng)對細菌存活能力的影響。在生物膜形成實驗中發(fā)現(xiàn)，RelBE-1、RelBE-4、RelBE-7和Phd/Doc4個缺失株在培養(yǎng)過程中形成的生物膜較弱，說

5、明了這4組系統(tǒng)參與了生物膜形成，這可能是導致RelBE-4和RelBE-7定殖能力下降的原因之一。在TA系統(tǒng)與細菌耐藥性關系的研究中，發(fā)現(xiàn)13株缺失株對氨芐霉素、氯霉素、四環(huán)素、萘丁酮酸以及慶大霉素的最低抑菌濃度與野生株相比并無明顯差異;在對宿主相似因子敏感性檢測中，發(fā)現(xiàn)RelBE-4缺失株對過氧化氫(H2O2)的耐受性較野生株更為敏感;所有缺失株對膽鹽敏感程度與野生株相比沒有明顯差異;因此推測可能以上實驗條件不能引起TA系統(tǒng)在耐受宿主

6、因子過程中發(fā)揮功能。同時，由于多套TA系統(tǒng)的存在導致基因層面調(diào)控的復雜性以及功能上的互補性，也提示研究多重缺失株對宿主因子耐受性是目前的趨勢。
　　霍亂弧菌中存在TcpA、MshA和PilA等Ⅳ型菌毛，在細菌致病過程中起到重要作用。本文在體外條件下發(fā)現(xiàn)了TcpA缺失株對H2O2的耐受性降低，回補TcpA后敏感程度可以恢復到野生株水平;同時pilA缺失株對H2O2較野生株敏感。體外純化的TcpA蛋白并不具有清除H2O2、保護細胞的作

7、用。對TcpA缺失株中過氧化氫酶KatB的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)其表達量在缺失株中較野生株低，因此提示了TcpA可能起到感受氧壓進而將信號傳給過氧化氫酶等作用。通過加入H2O2后檢測蛋白的表達以及定位情況，發(fā)現(xiàn)H2O2并不會影響TcpA蛋白的表達、分泌以及錨定，在膜蛋白中可以檢測到等量的TcpA蛋白。進一步發(fā)現(xiàn)在TcpA蛋白中，兩個半胱氨酸為關鍵位點，將其突變后導致TcpA蛋白的快速降解，由于這兩個氨基酸可能會形成分子內(nèi)二硫鍵，因此破壞

8、二硫鍵的形成可能對蛋白的結構造成影響，也說明這兩個氨基酸位點對于蛋白結構的穩(wěn)定性至關重要。但是Ⅳ型菌毛參與細菌抗氧化性機制還待進一步研究，本文發(fā)現(xiàn)作為毒力蛋白的Ⅳ型菌毛可能參與細菌抗逆境反應，對H2O2的不耐受性也是導致產(chǎn)生定殖缺陷的一個原因，提示了毒力因子在定殖過程中發(fā)揮的新功能，為后續(xù)致病機制的研究奠定了實驗基礎。
　　細菌胞外多糖與粘液素的互作對霍亂弧菌定殖產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)不同血清型的菌株大都表現(xiàn)出在粘液素中游動性加快的

9、現(xiàn)象，并且不同的營養(yǎng)環(huán)境會影響霍亂弧菌在粘液素中的游動速率。實驗室前期數(shù)據(jù)表明霍亂弧菌胞外多糖會減慢霍亂弧菌在粘液素的游動性。本文乳鼠競爭定殖實驗證實胞外多糖產(chǎn)生過量會影響細菌在小腸的定殖，造成定殖能力下降，推測其原因就是由于產(chǎn)生過多胞外多糖導致細菌穿過粘液層速度和擴散速度減慢，細菌穿過粘液層效率下降。這個結果是細菌與宿主因子相互作用的重要體現(xiàn)。同時細菌胞外多糖的產(chǎn)生受到粘液素和群體感應系統(tǒng)的調(diào)控，細菌群體可能通過自身和群體感應系統(tǒng)調(diào)控

10、胞外多糖合成基因的表達來改變細菌穿過粘液層的速度從而達到高效定殖。本研究進一步加深了對霍亂弧菌定殖過程的認識。
　　綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在宿主內(nèi)成功定殖是一個復雜的過程，不同生理系統(tǒng)相互影響形成網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)。一種生理系統(tǒng)通過對霍亂弧菌不同生理行為發(fā)揮作用，從而影響細菌的定殖能力?；魜y弧菌毒素/抗毒素系統(tǒng)的激活可能依賴于宿主環(huán)境，同時毒素/抗毒素不僅影響生物膜的形成能力，并且也會導致產(chǎn)生定殖差異;而毒素共調(diào)節(jié)菌毛蛋白TcpA不

11、僅影響細菌在宿主體內(nèi)的粘附能力，同時還通過自身影響細菌群體的抗氧化脅迫反應，幫助細菌在宿主內(nèi)生存以及定殖?；魜y弧菌不僅通過胞外多糖影響生物膜的形成從而影響其在腸道中的吸附能力;還利用胞外多糖與粘液層分子間相互作用影響細菌通過粘液層的速度，從而影響其在腸道中的定殖能力。本文揭示了霍亂弧菌與宿主相互作用的復雜性，研究這些因素對霍亂弧菌定殖以及致病性的影響具有重要的意義，為進一步深入了解霍亂弧菌在宿主體內(nèi)生存能力以及感染過程的具體細節(jié)和防治霍