通過(guò)斑馬魚(yú)模型研究霍亂弧菌致病相關(guān)基因?qū)ζ湓谥虚g宿主腸道定殖能力的影響.pdf

1、霍亂弧菌（Echolerae）是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧、水生的弧菌，同時(shí)也是人類(lèi)烈性傳染病霍亂的病原體。目前對(duì)霍亂弧菌在實(shí)驗(yàn)室條件和致病條件下基因表達(dá)調(diào)控的研究較為詳細(xì)，但對(duì)其在自然水體中的生存情況及相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究較少，主要是由于缺少合適的模型?；魜y弧菌在淡水中一般不能獨(dú)立生活，需要附著在水生動(dòng)、植物體表才能生存，因此魚(yú)類(lèi)可能是霍亂弧菌的中間宿主之一。而斑馬魚(yú)（Daniorerio）模型是研究與動(dòng)物相關(guān)的微生物在活體條件下生長(zhǎng)

2、或致病的一種相對(duì)簡(jiǎn)單和方便的動(dòng)物模型。
　　為了建立斑馬魚(yú)模型研究自然條件下霍亂弧菌的生存和定殖情況，本文將斑馬魚(yú)放在含有約1×105CFU/mL霍亂弧菌的水中，發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在24h內(nèi)就能在斑馬魚(yú)的腸道中定殖。
　　首先，通過(guò)霍亂弧菌毒力調(diào)控相關(guān)基因的缺失突變株與野生型菌株的競(jìng)爭(zhēng)定殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)△luxO和△aphA突變株的競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)與其它突變株相比差異最大，分別為0.122和7.655，說(shuō)明這兩個(gè)基因的缺失對(duì)霍亂弧菌在斑馬魚(yú)體

3、內(nèi)定殖能力影響最大;但是在乳鼠模型中，aphA的缺失突變株在腸道定殖的能力小于野生型菌株。同時(shí)與群體感應(yīng)相關(guān)基因的缺失對(duì)霍亂弧菌在斑馬魚(yú)模型中定殖能力的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于在乳鼠模型中，因此毒力調(diào)控相關(guān)基因的缺失對(duì)霍亂弧菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)定殖能力的影響較小。
　　其次，在單獨(dú)定殖實(shí)驗(yàn)中，△toxT突變株的定殖數(shù)量與野生型菌株相當(dāng)，說(shuō)明毒素共調(diào)節(jié)菌毛(TCP)并沒(méi)有在斑馬魚(yú)體內(nèi)表達(dá)，因此對(duì)其在斑馬魚(yú)體內(nèi)定殖沒(méi)有影響，這是與霍亂弧菌在乳鼠小腸中定

4、殖時(shí)區(qū)別最大的地方，推測(cè)霍亂弧菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)定殖以生存、增殖為主要目的。綜合比較基因缺失突變株和野生型菌株在單獨(dú)和競(jìng)爭(zhēng)定殖實(shí)驗(yàn)中的定殖情況，發(fā)現(xiàn)△hapR突變株（該菌株在兩種情況下定殖數(shù)量沒(méi)有顯著性差異）在競(jìng)爭(zhēng)定殖實(shí)驗(yàn)中使野生型菌株的數(shù)量比其在單獨(dú)定殖時(shí)增加了11倍;而野生型菌株（該菌株在兩種情況下定殖數(shù)量沒(méi)有顯著性差異）使△aphB突變株的數(shù)量比單獨(dú)定殖時(shí)下降了54倍。說(shuō)明不同基因的缺失對(duì)霍亂弧菌在中間宿主體內(nèi)與其它菌株的競(jìng)爭(zhēng)時(shí)產(chǎn)生不

5、同的影響，這對(duì)揭示霍亂弧菌在自然條件下的生存機(jī)制提供了新的思路。
　　最后，本文選取了LuxR家族、LysR家族以及胞外蛋白酶家族中一些基因缺失突變株，研究它們?cè)诎唏R魚(yú)體內(nèi)定殖的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LuxR家族的vc1277基因缺失突變株在斑馬魚(yú)體內(nèi)定殖能力比野生型菌株提高了4.548倍，且有研究表明斑馬魚(yú)腸道能產(chǎn)生AHLs類(lèi)信號(hào)分子，該分子是LuxR蛋白的誘導(dǎo)物，它可與LuxR蛋白結(jié)合從而影響其下游基因的表達(dá)。在LysR家族蛋白中，△

6、oxyR突變株在單獨(dú)接種實(shí)驗(yàn)中的定殖數(shù)量比野生型菌株降低了約16倍，但是當(dāng)二者競(jìng)爭(zhēng)定殖時(shí)，ΔoxyR突變株與野生型菌株的定殖數(shù)量無(wú)顯著性差異，而相同的試驗(yàn)在乳鼠模型下則沒(méi)有任何差異，說(shuō)明OxyR調(diào)控氧代謝相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)霍亂弧菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)抵抗ROS的過(guò)程中發(fā)揮了作用。而在胞外蛋白酶基因缺失突變株中，基因vc0524、vca0849和vca0812編碼的蛋白酶對(duì)于霍亂弧菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)定殖起到了抑制作用。同時(shí)，△prtV突變株在水體中比野