致病性霍亂弧菌特異性基因序列三重TaqMan實時定量PCR快速檢測體系的建立.pdf

1、目的：建立針對產毒性01群及0139群霍亂弧菌的高敏感、高特異的實時熒光三重TaqMan聚合酶鏈式反應快速檢測體系。探討該體系對臨床模擬標本檢測的意義，為該體系的臨床應用提供可靠的技術依據。 方法：根據01群霍亂弧菌主基因組O抗原編碼基因rfb-01、0139群霍亂弧菌主基因組0抗原編碼基因rfb-0139和霍亂腸毒素的A亞基編碼基因ctxA的特異性序列設計引物及TaqMan探針，構建各個目的靶序列的重組質粒，制備濃度為1.0×

2、1010～1.0×10-1拷貝/ul的質粒梯度稀釋模板，并將01群和0139群霍亂弧菌基因組DNA分別梯度稀釋至1×105 pg到1×10-3 pg，利用便攜式Smart cyclerⅡ實時熒光PCR檢測平臺探討該檢測體系的敏感性，用19種其他腸道致病菌及院內感染常見致病菌評價該檢測體系的特異性。將01群霍亂弧菌滅活菌株懸液[1.0×1011 CFU(菌落形成單位)/ml]連續(xù)10倍稀釋后與健康成人新鮮糞便混勻，制備成5.0×101～5

3、.0×109 CFU/g梯度濃度的模擬帶菌者糞便標本，將0139群霍亂弧菌滅活菌株懸液[1.0×1010CFU<菌落形成單位)/ml]連續(xù)10倍稀釋后與健康成人新鮮糞便混勻，制備成5.0×101～5.0×108 CFU/g梯度濃度的模擬帶菌者糞便標本，提取DNA，用以評價產毒型01群及0139群霍亂弧菌實時熒光雙重TaqMan PCR法對臨床模擬標本檢測的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。 結果：實時熒光三重TaqMan聚合酶鏈式反應快速

4、檢測體系對重組質粒的檢測敏感度為1.0×102拷貝每反應體系；對01群霍亂弧菌基因組DNA的檢測敏感度為1.0×10-1pg每反應體系；對0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測敏感度為1.0×10-1pg每反應體系；該實時熒光三重TaqMan聚合酶鏈反應快速檢測體系對01群霍亂弧菌或0139群霍亂弧菌的模擬帶菌者糞便標本的檢測敏感度均為1.0×103CFU每反應體系，亦相當于模擬帶菌者糞便標本5.0×104 CFU/g；對不同含菌量的模擬

5、帶菌者糞便標本的三次重復實驗結果顯示，各靶序列擴增反應CT值的檢測變異系數均小于5％；對新鮮健康成人糞便標本的檢測未見明確的異常擴增。該檢測體系在檢測19種與霍亂弧菌具有相同生活環(huán)境的細菌時不存在非特異性擴增；在特異性評價中，3名健康成人新鮮糞便標本的陰性對照均未見異常擴增曲線。整個反應在3個小時內完成。 結論：該研究建立的實時熒光三重TaqMan聚合酶鏈式反應檢測體系可作為糞便中01群或0139群霍亂弧菌特異、敏感、快速的檢測